在植物的QTL定位最后阶段，会把QTL定位到一个很小的区间，这里面可能有几个候选基因，如何进行下一步的分析是个很头疼的问题，这其中一个办法就是使用自然群体进行关联分析(GWAS)，得到群体中这些基因的DNA序列和promter序列，然后根据表型进行GWAS，下面简单的介绍一下相关的步骤：

1、提取材料的DNA

根据自己的研究使用适当的方法提取DNA，常用的方法有SDS，SLS，CTAB法。

2、设计引物

根据基因的长度将基因分为若干份，推荐一段为1500bp左右，因为下一步测序时使用的是一代测序技术，他的一个反应可以测800bp左右，这样正反两个方向就是1600bp，你还得保证两段有50--100bp的overlap，便于下一步的拼接。而设计引物直接在NCBI上使用primer-blast就可以了，一段序列一次最好设计两对引物，提高效率。

3、基因的扩增

通常情况下使用PCR产物进行测序得到的序列就可以进行下一步的分析，因为你要扩增的是大量的材料，一两次的突变在之后的分析中可以过滤掉。

4、序列的拼接

将多端的序列进行拼接，在拼接时可以提供一个参考序列一起进行拼接，保证拼接的准确性。

5、数据的预处理

在去GWAS分析之前，需要对数据进行预处理，保证软件能够识别

• 基因型数据
  将拼接好的数据保存为fasta格式的文件，序列的名称修改好，使得以后能够知道这段序列来自哪个材料。然后使用MEGA-X对序列进行比对，将比对结果保存为fasta格式的文件。

#类似的结果
>file1
ATCGATCGATCG----ACGT
>file2
ATCGATCG--CG----ACGT
>file3
ATCGATCGATCGATCGACGT

• 表型数据
  表型数据中，每个性状为一列，每个材料为一行，缺失的以NaN表示
  表型数据

6、使用tassel进行GWAS

打开tassel软件，点击file来打开表型数据和基因型数据，然后对基因型进行过滤filter-sites，设置一定的阈值，得到过滤后的数据进行PCA分析和kinship分析，将基因型数据、表型数据和PCA结果整合为一个结果，然后和kinship结果一起使用MLM模型进行分析，最后对结果画manhattan图，也可以使用R进行绘图。保存结果数据时，保存为plink格式的结果。

7、使用[haploview]进行单倍型分析

首先是就是对plink格式文件进行修改，将map文件的第一列和第三列删除，并把文件后缀map给为info，然后将ped文件的第二列复制到第一列，第3、4、5、6的数据改为0、0、0、1，将碱基缺失的（即文件中的 - 改为 N ）。
打开haploview软件，以linkage format格式输入。

对结果的解读根据自己的实际情况进行分析。

参考：

命令行中tassel的使用
批量修改文件后缀名
LD衰减距离--haploview