在单细胞测序基因组方向，Nicholas Navin团队可以称之为里程碑式的研究。最近通读其中一些经典文章，以增加在单细胞基因组方向的认知。

Ref：Punctuated copy number evolution and clonal stasis in triple-negative breast cancer

Public: Nature Genetics Date：2016

摘要

非整倍体是乳腺癌的hallmark，然而我们对于肿瘤发生过程中复杂的基因组重排如何进化的了解是有限的。在这篇研究中，我们开发了一个highly multiplexed single-nucleus测序方法去研究三阴性乳腺癌中患者的拷贝数进化。我们测序了来自12个肿瘤患者的1000个单细胞，每一个肿瘤中都识别到了1-3个主要的克隆亚群，他们shared一个共同的进化谱系。对于每个肿瘤，我们同样还识别了一个minor亚群，这个亚群没有克隆细胞，被归类为亚稳态的、假二倍体的、以及chromazemic（翻译为色原性的）。系统发生分析和数学模型暗示了，这些数据不太可能解释为拷贝数事件的逐渐积累随着时间的推移。相比之下，我们的数据挑战了渐进进化的范式，表明大多数拷贝数畸变是在肿瘤进化的最初获得的，在短间断爆发中，随后稳定的克隆扩张形成了肿瘤肿块。

背景

非整倍体在人类癌症中普遍存在，并且经常在乳腺癌患者中检测到(90%)。DNA拷贝数畸变往往通过致癌基因的过表达或者抑癌基因的下调导致gene dosage效应。然而大多数基因组研究都是从单一时间点分析样本，这使得研究肿瘤发生过程中染色体进化的自然过程变得困难。

Currently, the prevailing model for copy number evolution posits that CNAs are acquired gradually and sequentially over extended periods of time, leading to successively
more malignant stages of cancer
目前，流行的拷贝数进化模型认为，CNAs实在一段较长时间内逐步、循序获得的，从而导致癌症依次进入更恶性的阶段。
另一种模型是间断拷贝数进化（PCNE：punctuated copy number evolution)，即在短时间的危机爆发中获得CNAs，随后稳定的克隆扩增形成肿瘤团块。

之前的研究涉及了一个解释染色体局部重排的间断模型。包括染色体碎裂，？？？然而，有限的数据表明，全基因组非整倍体在肿瘤进化的早期阶段以短时间间断的爆发出现。

瘤内异质性通过发生在肿瘤进展过程中的、永久记录的突变在时间上提供了一个窗口。

假设突变复杂性随时间增加，就有可能重建肿瘤的进化历史并研究PCNE。然而，大多数的肿瘤是由不同的基因型的单细胞组成的复杂混合物，使研究复杂化。为了解决这个问题，我们之前开发了一个单细胞DNA测序法，成为单核测序。
我们将该方法应用于2例乳腺癌患者的单个肿瘤细胞测序，从而提供了PCNE的初步证据。

但是，这些数据仅限于2例患者，主要是因为SNS相关的高成本和低通量。为了应对这些挑战，我们开发了一种高度多路复用的单核测序技术，可并行分析48-96个单细胞。

在这个研究中，我们应用HM-SNS方法研究TNBC患者的CNAs的克隆亚结构和进化。

基因组研究表明，TNBC患者在体细胞突变中表型出大量的患者之间的异质性，以及每个肿瘤块内的广泛的瘤内异质性。

Results

Section 1 Highly multiplexed single-cell copy number profiling

HM-SNS方法测序12个肿瘤患者的1000个单细胞，平均每个患者检测到83个单细胞

Section 2 Clonal substructure and diversity during tumor growth

为了描绘每个肿瘤的克隆亚结构，我们对非整倍体的单细胞拷贝数图谱进行了一维的层次聚类。

12个患者的拷贝数一维层次聚类结果

可以看出，在每个肿瘤中，聚类热图识别了1-3个主要的克隆亚群。对于每一个亚群，单个细胞具有高度相似的拷贝数分布(平均成对r = 0.87)，表示在肿瘤生长过程中发生了稳定的克隆扩展。

为了定量地确定每个肿瘤的最佳聚类数，我们应用了PAM聚类。

PAM结果与大多数患者的层次聚类结果一致 PCA同样和层次聚类的结果一致

PCA同样和层次聚类的结果一致，展示了1-3个主要的clusters。

克隆频率

我们量化了亚群的基因型频率，发现一些克隆在肿瘤肿块中获得更高的频率。

为了计算克隆多样性的全局度量，我们计算了每个TNBC患者的Shannon多样性指数

这些数据表明，大多数TNBC肿瘤由1-3个主要克隆亚群组成，复杂的非整倍体肿瘤图谱在肿瘤生长过程中高度稳定(克隆停滞)。

Section 3 Divergent subpopulations in polyclonal tumors

多克隆肿瘤在亚群中共享大多数的CNAs，但克隆也因肿瘤进化后期出现的一些离散的亚克隆事件而不同。亚克隆的CNAs区分克隆，常常导致癌基因的扩增和肿瘤抑制基因的缺失。在一些cases中，亚克隆CNAs与肿瘤中相应的克隆的基因型频率增加相关，暗示着他们可能提供了一个适应性优势。
为了进一步研究这种可能性，我们计算了多克隆肿瘤中的克隆频率(cf)

T3患者中，相较于主要克隆B，克隆A有一个额外的10p和12q的扩增 T2患者中，克隆A有明显的5号染色体的扩增

这种现象同样发生在T5和T8患者中，这些数据表明，除了进行稳定的克隆扩增，TNBC患者的肿瘤可以在肿瘤进展的后期继续获得单个CNAs，这些事件与新亚群发病率的增加有关。

Section 4 Non-clonal copy number profiles in tumors

尽管大多数癌细胞聚集成1-3个主要的克隆亚群，我们也在每个肿瘤中发现了一小部分(<10%)非克隆单细胞拷贝数谱。非克隆的拷贝数图谱发生在非整倍体中大约7.4±0.8%，在二倍体中，大约7.9±1.4%。5.9 ± 1.0% 在邻近的正常组织中。基于CNA谱的模式，我们鉴定了三大类非克隆细胞:(i)亚稳态肿瘤细胞，(ii)假二倍体细胞和(iii)染色细胞。

亚稳态肿瘤细胞是一种非整倍体癌细胞，它的拷贝数与主要亚群的拷贝数高度相似，但却进化出额外的单个染色体或染色体臂的增益或损失。

来自肿瘤T3的一个亚稳态肿瘤细胞与主要非整倍体亚群的肿瘤细胞相比，显示了染色体5p的额外扩增（left）
在肿瘤T6，与主要的非整倍体肿瘤亚群相比，显示出一个亚稳态肿瘤细胞增加了染色体18p的扩增（right）

左边T3患者，右图T6患者.png