2018年8月28日，德国马克思-普朗克化学生态研究所Ian T Baldwin团队在eLife上发表了题为Blumenols as shoot markers of root symbiosis with arbuscular mycorrhizal fungi的研究性论文。当前判断植物与AMF是否存在共生关系，主要是通过破坏性取样后的显微镜检或转录分析，这种方法既耗时又费力。本研究首次揭示了在植物地上部中有2种仅存在于植物-AMF共生体中的特异性布卢门醇，借助这种特异性地上部标记物能轻松判断植物是否与AMF建立了共生关系，为今后AMF研究提供了一种简便方案。
1. 前言
大多数高等植物都能与丛枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）建立共生关系。由于AMF具有促进植物吸收矿质养分和水分、增强植物抗逆性的积极作用，因此成为近几十年来的研究热点。接种AMF会影响植物的代谢反应，如影响糖类、蛋白质、氨基酸和其它次生代谢产物的合成。然而，在胁迫条件下这些代谢反应也会受到影响，即这些代谢产物并非AM共生体的特异性代谢产物。布卢门醇类化合物是一种脱辅基类胡萝卜素，是由类胡萝卜素裂解产生的，主要包括三种类型：布卢门醇A、布卢门醇B和布卢门醇C（图1）。有研究指出，AMF会引起植物根系布卢门醇C的积累，而其它外界因素均不会发生此类变化。不仅如此，布卢门醇同样也存在于植物地上部，但此前尚没在植物地上部发现AM共生体所特有的布卢门醇类化合物。
目前判断植物与AMF互作的方法耗时且费力，所以在植物地上部寻找一种稳定的代谢标记物对于AMF研究具有重要的实际意义。本文通过一系列试验，并使用多种植物材料和AMF菌种进行验证，在植株地上部鉴定出了2种实用性广的AM共生体特异性代谢标记物。
图1布卢门醇的核心结构及其常见构型
2. 材料与方法
2.1. 材料与设计
植物材料：烟草（Nicotiana attenuata）31代近交系（遗传稳定性强）、irCCaMK植株（RNAi沉默掉CCaMK基因后，植株无法与AMF建立共生，但植株生长和根系相关微生物不受影响）、i-irPDS植株（RNAi沉默掉PDS基因后，植株发生光漂白，以减轻类胡萝卜素合成对布卢门醇代谢的影响）以及各自的空载（EV）植株。
温室试验：试验包括接种异形根孢囊霉（Rhizophagus irregularis）和不接种（高温灭活的Rhizophagus irregularis）处理，成对比较试验中将irCCaMK植株和EV植株一起种于2 L盆中，其余温室试验均是将植株分开种于1 L的盆中。
大田试验：大田试验在美国莱特尔牧场保护区进行。
其它试验：苜蓿（Medicago truncatula）和二穗短柄草（Brachypodium distachyon）接种变形球囊霉（Glomus versiforme）后，置于美国博伊斯汤普森研究所的生长室生长；此外，德国莱布尼茨植物和观赏作物研究所的Michael Bitterlich博士负责番茄（Solanum lycopersicum）和马铃薯（Solanum tuberosum）试验，接种菌种为异形根孢囊霉（Rhizophagus irregularis DAOM 197198）或摩西管柄囊霉（Funneliformis mosseae BEG12）。
2.2. 胁迫处理
虫害处理：将烟草天蛾（Manduca sexta）幼虫置于植株叶片上，两周后取样，取样部位为烟草莲座叶。
细菌和病毒处理：将烟草脆裂病毒（Tobacco Rattle Virus）导入到根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）中，并使用注射器将细菌悬浊液浸润叶片，接种三周后取样。
真菌处理：将含有灰霉菌（Botrytis cinerea）孢子的悬浊液滴在叶片表面进行处理，在接种四天后取样。
干旱处理：停止浇水持续四天，然后取样，并记录两种水分处理导致的鲜重差。
2.3. 样品的提取与纯化
提取样品：100 mg植物叶片（或根系）+1 mL 80%甲醇+2颗铁珠，每分钟震荡1150次，1分钟后收集上清液用于分析。
纯化样品：使用45 μm的苯磺酸阳离子交换柱，去除掉样品的主要成分，如尼古丁和酚酰胺，纯化之后将样品烘干然后溶于80%的甲醇中。
纯化的根系和叶片提取物使用核磁共振鉴定其成分。
2.4. 其它试验方法
非靶向质谱分析：使用非区分串联质谱法（idMS/MS）、串联质谱法（MS2）和pseudo-MS3进行高分辨率质谱分析。
核磁共振分析化合物结构：纯化的样品用N2吹干后溶于甲醇溶液中，再用核磁共振仪分析化合物结构。
靶向代谢分析：使用超高液相色谱法进行色谱分离，以减少其它成分的干扰，增加该分析方法的特异性。
AMF侵染率：首先用WGA-Alexa Fluor 488荧光染料和台盼蓝染料将根段染色，然后使用显微镜记录菌根侵染率和菌根结构。此外，还通过提取根系RNA进行侵染率的分子生物分析。
转录组分析：对烟草根系脱辅基类胡萝卜素途径进行转录组分析。
布卢门醇转运试验：将烟草幼苗种于离心管中，用封口膜固定植株，并使幼苗根系与地上部分别位于管内和管外，管内装满0.5%的植物提取物——化合物1、化合物2（AMF诱导的特异性布卢门醇），或药剂——化合物6（非AMF诱导的特异性布卢门醇）（3种化合物的结构见图6C），且使用相同浓度的甲醇溶液作为对照，在生长室孵育24 h后取样分析。
八氢番茄红素脱氢酶（PDS）基因沉默：使用100 μM的地塞米松处理基部第二片茎叶，每周两次，持续三周，取样部位为处理叶片及其上下邻近叶片。
3. 结果与分析
3.1. 布卢门醇是根系中AMF特异性代谢指纹
将EV植株和irCCaMK植株同种于一个2 L容器中，试验处理包括接种/不接种异形根孢囊霉，6周后取根系进行非靶向代谢分析，共鉴定出了8种化合物，包括尼古丁、酚酰胺、酚醛树脂和5种未知化合物，根据其在不同处理时的含量变化确定了各物质的代谢模式，发现EV植株接种AMF后，根系中布卢门醇大量合成，而irCCaMK植株或不接种植株中布卢门醇含量微乎其微甚至不存在，这与前人研究结果吻合，因此布卢门醇可作为根系中AMF特异性代谢指纹（图2）。
图2 通过靶向和非靶向代谢分析验证布卢门醇作为AMF特异性代谢指纹的可行性
3.2. 叶片中化合物1和2的水平与根系侵染率呈正相关
通过布卢门醇转运试验发现，化合物1和化合物2（分别为羟基类布卢门醇、羧基类布卢门醇）同样也在接种植株叶片中特异性聚集（图2D）。随后，通过普通接种试验、梯度接种试验、本地接种试验和大田试验，检测了AMF特异性叶片化合物1和化合物2与根系菌根侵染率的关系，发现叶片中两种化合物随着接种时间延长而稳定增加，接种3周后叶片中两种化合物的丰度便足以反应根系侵染率，且两种化合物与丛枝、泡囊和侵染率呈正相关，最后通过分析两种化合物与植株空间位置的关系发现，这两种化合物几乎遍布全株，即叶片中化合物1和化合物2的水平与菌根侵染率呈正比（图3）。最后通过基因转录丰度分析和胁迫处理试验，验证了化合物1和化合物2是AMF特异性诱导的特异性标记物，对AMF研究具有不可替代的作用（图4和图5）。
图3 接种AMF对两种化合物含量的影响
图4 接种AMF对叶片中AM共生标记基因转录丰度的影响
图5 不同胁迫处理对烟草叶片及两种化合物的影响
3.3. 地上部AMF特异性布卢门醇可能起源于植物根系
布卢门醇是一类脱辅基类胡萝卜素，源自类胡萝卜素合成途径的侧支。通过检测合成布卢门醇的候选基因发现，根系中大多数候选基因在接种后上调，而在叶片中并未出现这样的现象，即叶片中不能直接合成布卢门醇。因此提出假设：布卢门醇是在根系中合成然后转运至植株地上部的，因此使用地塞米松（DXE）诱导pOp6/LhGR系统，沉默掉PDS基因，以降低类胡萝卜素合成对植物-AMF互作的影响。试验发现非特异性化合物6含量显著降低，而AMF特异性化合物1和化合物2含量未受影响，且在根系中聚集，此结果验证了化合物1和化合物2并非在叶片合成，而是源自于根系。为进一步验证布卢门醇可从植物根系运输至地上部，该团队进行了布卢门醇转运试验，发现布卢门醇可通过根系扩散至全株。
图6 植株地上部AMF特异性化合物1和化合物2起源于菌根
3.4. 植物地上部AMF特异性布卢门醇分析可作为正向遗传学高通量筛选工具
为检测AMF特异性布卢门醇作为筛选工具的可行性，该团队测定了重组近交系（犹他州烟草×亚利桑那州烟草）植株叶片中化合物1和化合物2的浓度。由于在之前的大田试验中发现化合物2的信号质量更高，因此将重点放在化合物2的分析。将植株进行大田试验，通过对728株植株进行QTL分析发现，化合物2定位于连锁群3的一个单位点，这个位点含有NOPE1（NIATv7_g02911）（对玉米和水稻建立AMF共生是必需的）的同系物（图7 A-E），接种AMF后烟草根系中NOPE1转录水平更高，而烟草叶片中并无显著影响，突出了这些特异性代谢物对高通量筛选的价值。
图7 针对多种植物物种和AMF菌种验证布卢门醇的广泛适用性
3.5. 植物地上部AMF特异性布卢门醇可以广泛应用于各种植物和AMF互作研究
该团队对番茄、小麦和大麦植株接种/不接种AMF，同样发现根和叶中AMF特异性布卢门醇的变化，这与布卢门醇的运输假说相一致。此外，发现蒺藜苜蓿、马铃薯和二穗短柄草叶片中布卢门醇B也属于AMF特异性布卢门醇，这些布卢门醇均能在植株地上部聚集。也就是说，AMF特异性布卢门醇具有物种特异性，但在各类植物中也存在一套通用的模式。通过检测异形根孢囊霉、摩西管柄囊霉和变形球囊霉发现，这种影响并不局限于特定AMF菌种，而是具有普遍适用性（图7F）。
4. 结论
AMF能与大多数陆生植物建立共生关系，能改善植株生长势，因此调查AMF对宿主植物的影响至关重要。目前分析植物与AMF互作是通过对根系进行毁灭性采收或转录分析，这种方法较为笨拙且不利于大规模调查和商业应用。本文首次从AM共生体地上部发现了2种特异性布卢门醇（化合物1和化合物2），为今后AMF研究和植物育种提供了一种新的研究方法。
编辑∣冯曾威
审核∣姚青
广东省科学院微生物研究所菌种组-华南农业大学园艺学院土壤微生物组联合团队
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