今天跟大家分享的是最近发表在Molecular Therapy-Nucleic Acid上的一篇干湿结合的文章，影响因子7.032
Identification of a novel Tumor Microenvironment Regulating Factor that facilitatestumor immune infiltration in Colon Cancer
首先，让我们通过摘要了解一下这篇文章的主要内容。这篇文章研究的是结肠癌，它是最常见和最主要的恶性肿瘤之一。肿瘤微环境细胞参与结肠癌的进展和预后，然而，结肠癌肿瘤微环境重塑中的基因改变和潜在机制尚不清楚。作者以此为背景，在该研究中，使用ESTIMATE算法的免疫评分来区分免疫细胞浸润程度高或低的患者。识别出42种具有预后价值的免疫DEG。其中，KCNJ5是促进结肠癌M2 MΦs募集和肿瘤免疫浸润的关键因子。好啦，让我们一起来看一看作者具体都做了哪些研究以及得到哪些结果吧~
一.材料和方法
1.1数据收集与处理
从TCGA和UCSC xena浏览器下载COAD患者的基因表达谱数据和临床信息。表达数据表示为log2（count + 1）。根据ESTIMATE算法产生COAD患者的免疫评分，基质评分和ESTIMATE评分。
1.2识别DEG
根据R包edgeR筛选DEG，阈值为FC>2,p<0.05。
1.3 DEGs的富集分析与PPI网络构建
使用STRING数据库进行GO和KEGG富集分析。将蛋白质相互作用数据导入到Cytoscape 中构建PPI网络。评估分子复合物检测（M_CODE）分数，以通过拓扑算法搜索紧密相连的基因簇。
1.4 Transwell测定法和趋化性实验
这部分是实验部分，分为两个部分，一个是Transwell细胞迁移实验，它可以测定肿瘤细胞的迁移能力。另外一个是趋化性实验，这个模型可以检测出平面中的细胞趋化形式。通过Image J进行细胞计数。
1.5结肠癌细胞的异种移植肿瘤模型构建
这部分是小鼠实验，从苏州大学获得了雄性小鼠。将总共1×107个Scramble或shKCNJ5慢病毒稳定转导的HCT-8细胞注射入8周龄裸鼠的腹侧（每组n = 9）。每5天测量一次所有小鼠的体重，肿瘤体积和活性。
1.6异种移植肿瘤的免疫荧光表征
作者准备了异种移植肿瘤切片（5μm）的免疫荧光特性来进行免疫荧光分析。然后将它们固定，清洗并用含1％BSA和3％FBS的PBS封闭。最后，将切片用CD206抗体和IgG H＆L免疫染色。拍摄荧光，用Image J定量分析平均积分光密度。
1.7流式细胞仪用于细胞标志物评估
用0.25％的胰蛋白酶消化不同组的细胞，用PBS洗涤，并用70％的乙醇固定2小时。然后将其重悬于300µL PBS中，并用Alexa Fluorescence 488标记的CD206抗体染色。洗涤并重悬后，在流式细胞仪上检测细胞。使用Flowjo 7.6软件计算M2 MΦs百分比。
1.8 统计分析
组间的差异通过t检验（两组）或单向方差分析进行评估。P<0.05具有统计学意义。
二.结果展示
2.1 免疫、基质和ESTIMATE得分与结肠癌亚型显著相关
首先我们先来看下这篇文章的流程，作者从TCGA和UCSC xena数据库下载了471例COAD样本（共512例样本，共471例COAD和41例相邻的非癌组织）的基因表达谱，人口统计学和临床特征。临床病理分析显示腺癌399例（84.7%），粘液腺癌69例（14.7%），上皮性肿瘤3例（0.6%）。根据ESTIMATE算法，对263个COAD病例产生了免疫，基质，ESTIMATE评分（图1）。接下来进行了免疫相关DEG的生存分析，功能富集分析等，并通过实验进行了验证。
图1.流程图
免疫评分分布在-1131.91至1893.64之间，基质评分从-2053.75 1030.85变化，ESTIMATE评分分别在3143.54至2924.49之间（图2）。从分期来看，I期的免疫评分低于II期。腺癌亚型患者的免疫评分最低。从基质和ESTIMATE评分来看，这三种亚型分数排名为腺癌<粘液性腺癌<上皮性肿瘤，这表明免疫，基质和ESTIMATE评分在区分结肠癌的病理亚型中很重要。接下来作者评估了总生存期与免疫评分之间的关联。将196例 COAD病例分为高和低评分组。Kaplan-Meier曲线表明，高免疫评分组的中位总生存期比低免疫评分组要长。ESTIMATE评分也是如此。低基质评分组比高基质评分组的中位总生存时间长。
图2. 免疫评分，基质评分和ESTIMATE评分与结肠癌亚型和总体生存率相关
2.2结肠癌中与免疫微环境相关的基因signature的差异表达，功能富集，PPI分析
在这一部分，作者评估了整体基因表达谱与免疫评分之间的关系，对196例结肠癌患者的基因表达谱数据进行了高/低免疫评分组的比较。通过层次聚类热图对高和低免疫评分组前20个上调/下调基因的表达谱进行了展示（图3）。接下来作者进行了GO和KEGG富集分析，来看这些免疫DEG的潜在功能。GO分析中，免疫DEG在生物过程，细胞组分和分子功能这三个层面都有富集。对于KEGG通路分析，免疫DEGs在味觉传导、蛋白质消化和吸收、基质金属蛋白酶的活化和GPCR配体结合方面显著富集。GSEA分析主要显示趋化因子信号、白细胞反式内皮和TCA循环通路的富集。
图3. 结肠癌患者免疫评分的DEGs、GO、KEGG和GSEA富集分析
接下来作者研究了这些免疫DEG之间的相互作用，使用STRING在线工具和Cytoscape 构建了蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络（图4）。这个网络由8个模块组成，包括194个节点和226条边。INSL5是种子节点。平均节点度为2.33，平均局部聚类系数为0.405。作者选择了前4个重要模块进行进一步分析。主要关注的是模块1，其中模块1中节点的MCODE_score全部超过8。还对模块1中基因的表达倍数变化进行了展示，其中CCL25的表达倍数变化最大。在模块1-4中，免疫应答基因为核心基因，其功能还需进一步研究。这部分结果揭示了INSL5和DRD2在调节免疫细胞浸润和结肠癌恶化中的作用。
图4. 结肠癌中免疫DEG的PPI网络分析
2.3 Venn图与免疫功能预测的进一步分析
为了进一步获得具有预后价值的免疫细胞相关基因，作者进行了免疫DEG和生存显著基因的交集分析。筛选出802种在高，低免疫评分组中显著差异的免疫DEGs。在生存数据分析中选择了1066个具有生存意义的基因（图5）。两者之间有42种免疫DEG，可以显著预测结肠癌患者的生存率。接下来，作者就关注了这42个基因的功能。通路分析表明，这42个基因主要富集细胞衰老，P53和T细胞受体信号传导。还富集到许多GO 的生物学功能，比如内吞作用的正调控，G蛋白偶联肽受体的活性等。同样地，对这42个基因进行PPI网络分析。有4个主要模块，有34个节点和53条边。平均节点度为4.55。平均局部聚类系数为0.604。对于模块1，有48个边和10个节点。CCNA1是种子节点。在模块1-4中，占据核心位置的免疫应答基因分别是CCNA1，APOE，GPR83和NFATC1。
图5. GO、KEGG通路和PPI网络分析对结肠癌预后的影响
2.4 42个基因与总生存率的关系
为了描述42个基因在总体生存中的潜在作用，计算了风险（HR）并绘制了几个基因的Kaplan-Meier生存曲线（图6）。在42个有预后价值的基因（IDPVs）中，有39个免疫相关基因预测了较差的生存率（HR> 1）。这些基因的高表达显著预测了结肠癌患者的总体生存率低。
图6. Kaplan Meier分析
2.5 KCNJ5被确定为结肠癌肿瘤免疫微环境的关键因素
为了确定涉及肿瘤免疫浸润的关键因素，作者在前20个上调的IDPVs中选择了5个重要的基因进行进一步研究，包括CX3CL1，CCNA1，NFATC1，KCNJ5和SFRP2。M2 MΦ是预测结肠癌总生存率和HR>100的一种细胞类型。为了验证基因的表达，用PMA和IL4，IL13诱导M2 MΦs（图7）。在诱导的M2 MΦs中，M2标记CD206标记超过80％。与M2MΦs共同培养的HCT-8细胞中， PCR检测显示KCNJ5在5个关键基因中表达最高。结合先前的研究作者发现KCNJ5可能在肿瘤免疫浸润和肿瘤进展中起关键作用。接下来进行了transwell分析来探索KCNJ5的趋化作用。结果显示，与对照组相比，与KCNJ5-缺失的HCT-8细胞共培养后，M2 MΦs迁移能力明显减弱。然后作者进行趋化性试验，来确认KCNJ5对M2MΦs募集的促进作用。构建了细胞趋化模型，发现KCNJ5是促进结肠癌的M2MΦs募集的关键调节因子。这些结果表明，KCNJ5是结肠癌的M2MΦs募集和肿瘤微环境重塑的关键调节因子。
图7. KCNJ5促进M2MΦs对结肠癌细胞的趋化性
2.6 KCNJ5在体内促进M2MΦs浸润和异种移植生长
在这一部分,作者构建动物模型来研究体内肿瘤免疫浸润的KCNJ5功能。裸鼠分为两组，分别携带Scramble或shKCNJ5慢病毒转染结肠癌细胞（图8）。在异种移植瘤的免疫荧光片中发现，KCNJ5耗尽明显消除了M2 MΦs的浸润。流式细胞仪数据进一步表明，shKCNJ5显著降低了异种移植肿瘤中M2MΦ的浸润百分比。此外，shKCNJ5还明显抑制异种移植肿瘤的生长。但是，两组之间的体重均无见明显变化。这些数据巩固了KCNJ5在体内对M2 MΦs浸润和肿瘤微环境重塑的调节作用。
图8. KCNJ5在体内促进M2 MΦs募集和肿瘤生长
好啦~这篇文章内容就这么多啦，有分析意向（http://gaptechsxr.mikecrm.com/1vdMmqy）生信人WX公众号总之，在本研究中，作者通过TCGA数据库挖掘和实验验证，确定了一种肿瘤微环境调节因子KCNJ5，它对结肠癌的总体生存率有贡献。
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