小伙伴们大家好呀，今天要为大家介绍的是于2020年10月20日发表于cancers（IF=6.126）的文章，作者单位是德国亚琛工业大学附属医院。
本研究正常分析样品和膀胱癌样本之间鉴定出差异甲基化位点,发现基于免疫细胞相关的CpG（甲基化）位点构建膀胱癌分子亚型的新分类。
基于免疫浸润和甲基化进行膀胱癌分子亚型的分类
科学问题 分析意向（http://gaptechsxr.mikecrm.com/1vdMmqy）生信人WX公众号
已证明各种免疫疗法可以成功治疗多种致死性癌症。FDA已经批准了两种细胞因子作为抗癌剂，以对抗肾癌和转移性黑色素瘤。但是，个体对治疗的反应率存在显着的异质性，但并非所有免疫疗法都能成功治疗患者。有几种类型的免疫疗法可以治疗膀胱癌（BC）。但是，并非所有患者对免疫疗法都有相同的反应。研究报道，只有大约20％的患者可以从免疫疗法中显着受益。因此，必须开发准确的分类方法以帮助增强BC患者对免疫疗法的反应的最佳方案。
结果分析
（1）首先，从以前的研究中选择了782个与免疫细胞生物标志物相关的基因，并获得了8703个与免疫细胞生物标志物相关的甲基化位点。渗透参数为调整后的p值<0.05和|deltabeta|>0.2。在正常样品和肿瘤样品之间鉴定出715个DMS（图1A）。揭示p值<0.05和deltabeta>0.2的探针被定义为超甲基化，而p值<0.05和deltabeta<0.2的探针被定义为低甲基化。总共获得了553个dna低甲基化位点和162个高甲基化位点。
图1. 基于亚甲基化位点的三个亚组
（2）715个DMS的共有簇被分为三个亚型（图1C）。簇1显示中等范围的甲基化，簇2显示最高的甲基化水平，而簇3显示最低的甲基化。主成分分析（PCA）用于检查分类的稳定性（图1D）。使用Kaplan-Meier方法获得了BC子集的总体生存（OS）曲线（图2A）。聚类1的预后最差。聚类3的预后最好。接下来，在每对亚型之间进行了对数秩检验，发现仅在聚类1和聚类3之间存在显著差异。但是，一些研究报告说，每对集群之间没有显著差异是不必要的。此外，亚序列分析表明，生物机制具有重要意义，并且三个亚组之间的临床意义不同。因此，我们将BC分为三个集群。研究显示了亚型的临床特征与生物学特征之间的关系（图2B-H）。除年龄外，三个亚组之间的其他临床病理特征具有显著差异。
图2. 总体生存曲线和临床病理特征
（3）接下来，使用卡方检验比较了三个亚组之间的DNA甲基化水平和免疫基因水平。图3A显示了与免疫细胞生物标志物相关的差异甲基化水平。聚类1显示中等范围的甲基化水平，聚类2显示最高甲基化水平，聚类3显示最低甲基化水平。图3A中的结果与图1C一致。DNA甲基化水平提供了三个亚组之间的显著差异。结果还发现三个亚组之间的免疫基因水平显著不同（图3B）。使用Wilcox检验比较一个亚组中的甲基化表达与其余亚组中的甲基化表达。在簇1，簇2和簇3中分别发现了14、540和136个具有较高表达水平的甲基化位点。亚型簇1和簇2之间有14个甲基化位点重叠。但是，在其余簇对中未发现重叠的甲基化位点。
图3.甲基化水平和基因水平
（4）在图4A中，簇1具有中等范围的免疫浸润。与簇3的免疫浸润低不同，簇2显示了与高免疫浸润的相关性。比较了三种亚型之间的免疫浸润，这些亚型之间存在显著差异（图4B）。显然，免疫检查点显示出这些亚型之间存在显著差异（图4E）。
图4. 三个亚组之间的免疫状态
（5）肿瘤微环境包含基质细胞，肿瘤细胞和免疫细胞。基质评分和免疫评分越高，肿瘤的纯度越低。如图4F-I所示，第2组的间质评分最高，免疫评分为ESTIMATEScore，而肿瘤纯度最低。相反，簇3具有最低的基质评分，免疫评分，ESTIMATEScore和最高的肿瘤纯度。
在这些亚型中，APC共同抑制，APC共同刺激，内皮细胞，成纤维细胞，HLA，促炎症，MHCI类，I型IFN_Response和II型IFN响应的生物标志物显著不同（图5）。
图5. 三个簇之间的免疫相关分子生物标志物
（6）启动子基因的DNA超甲基化抑制了基因表达，进而使癌细胞受益。因此，这些基因的下调可能通过DNA甲基化导致癌症干细胞和祖细胞的发生。在图7中的簇2中，RNA和DNA最低。
图6. RNA评分和DNA评分
（7）每个亚型中共有三十个免疫细胞相关基因具有最高的突变比例，如图8A-C所示。从每个亚组的上述三十个基因中鉴定出另外的五十八个与免疫细胞相关的基因。结果表明三种亚型之间的重叠较少（图8A-C）。此外，簇1中ITGA9，ENG，EVI5，ATIC和FZD2的突变显著高于其他亚型的突变。与其他亚型相比，簇2中CTSZ，HOXA1和KLRF1的突变也显著更高。同样，簇3中的DLC1，OSBPL1A，RRP12，C3AR1，MPZL1和ITK的突变明显高于其他亚型的突变。TMB仅在群集1和群集2之间有显著差异（图8D）。
然后，分析CNV数据，并提取391份正常组织和410份肿瘤组织。在将一组的CNV数据与其他两组的CNV数据（第1组，第2组和第3组）进行比较（图8E）。将一个亚组中的CNV数据与其他两个亚组进行比较。簇1中有一个具有显著拷贝数增加的基因，簇1中有三个具有显著拷贝数损失的基因。图8F显示了簇2中四个有显著拷贝数增加的基因和一个基因具有显著拷贝数损失的。在簇3中有两个具有显著的拷贝数增加的基因和四个具有显著的拷贝数损失的基因。
图7. 变异和CNV
（8）最后，文中解释了本研究分类的临床意义。研究分析了化疗对这三个亚组的影响。在这项研究中，使用化学疗法治疗了398例患者。如下表显示，第3组具有最高的腔内生物标志物表达和最低的免疫浸润，这表明在有和没有新辅助化疗的情况下，腔内亚型均具有良好的生存率。因此，我们仅比较了第1组和第2组之间的化疗信息和总生存率。在这项研究中，第2组中的80.2％的患者接受了化疗，而第1组中的95.9％的患者接受了化疗。CPD代表临床进行性疾病，CR代表完全缓解，PR代表部分缓解，SD代表稳定疾病。在第2组患者中，化疗后达到CR的占59.7％，而在第1组患者中，只有32.9％达到CR。我们发现第2类患者中有62.3％的患者对化学疗法有反应，包括CR和PR。但是，组1中53.2％的患者对化学疗法有反应。此外，Kaplan-Meier分析表明，第2组在化疗后的总生存中有更多的改善。所有以上结果表明，聚类2在化疗后的总生存中具有更高的改善。
表1. 对化疗的反应
总结分析意向（http://gaptechsxr.mikecrm.com/1vdMmqy）生信人WX公众号
研究思路如下图所示，本研究根据与免疫细胞相关的CpG位点，将BC患者成功地分为三种亚型。这三个亚组表现出不同的临床病理特征。免疫细胞的分布，检查点的表达水平，基质评分，免疫评分，ESTIMATEScore，肿瘤纯度，APC共同抑制，APC共同刺激，HLA，MHC I类，I类IFN反应和II类IFN反应显示出显著差异三个子组。发现特定的生物信号传导途径，免疫机制和基因组改变在三个亚组之间具有差异。高水平的免疫浸润与高水平的甲基化相关。较低的RNAs与较高的免疫浸润有关。聚类2与对化疗的更好反应相关。在三个亚组中，抗癌靶向药物治疗有所不同。肿瘤内免疫微环境的研究可能为BC治疗提供新的视角。
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