单细胞转录组测序（scRNA-seq）揭示猪窦卵泡细胞异质性和通

卵母细胞是哺乳动物生命的基础，它们在卵巢中的卵泡小囊中发育，卵母细胞发育的最后阶段发生在窦状卵泡（Antral Follicles）中。卵母细胞的成功生长和成熟取决于与邻近细胞（主要是颗粒细胞）的复杂互作。了解窦卵泡内这些颗粒细胞之间的差异以及如何双向通讯，对于了解哺乳动物如何繁殖和生长至关重要。

先前研究鉴定出窦卵泡中颗粒细胞的两种亚型：位于内部区域的卵丘颗粒细胞（cumulus granulosa cells，cGC）围绕并支持卵母细胞；以及位于外层的壁层颗粒细胞（mural granulosa cells，mGC）为卵泡壁提供机械支持并具有类固醇生成功能。单细胞转录组测序（scRNA-seq）研究揭示了山羊、小鼠和人类颗粒细胞和鞘细胞的异质性。然而关于关键发育事件、颗粒细胞异质性、功能注释和复杂的体细胞-卵母细胞相互通讯的基本问题在单细胞分辨率水平上仍未得到充分解决。此外不同类型颗粒细胞之间的通讯变化研究仍然有限，尤其是在家畜研究中。猪作为重要家畜和研究人类生殖生物学的重要模型，由于其生殖生理学相似性，可以为卵泡研究、卵母细胞获得、体外生产和胚胎操作以及畜牧业和人类医学进步提供重要见解。

2023年9月26日，中国农业科学院深圳农业基因组研究所高飞研究员团队和华南农业大学动物科学学院副教授袁晓龙博士团队联合在《Animals》杂志发表题为“Deciphering Cellular Heterogeneity and Communication Patterns in Porcine Antral Follicles by Single-Cell RNA Sequencing”的研究论文，研究从猪的窦卵泡中收集细胞，利用单细胞转录组测序（single-cell RNA sequencing）来分析其转录组谱。研究在窦卵泡内鉴定出不同的颗粒细胞亚群，且具有广泛的通讯能力。

研究摘要：

窦卵泡期是哺乳动物卵母细胞成熟的关键时期，其特征是卵母细胞发育与邻近颗粒细胞之间的复杂互作。了解窦状卵泡内颗粒细胞的异质性和通讯模式对于分析其在卵泡发育和卵母细胞成熟中的功能至关重要。本研究采用scRNA-seq来分析猪窦卵泡的分子和细胞特征，分析结果揭示了壁层颗粒细胞（mGCs）和卵丘颗粒细胞（cGCs）内的不同亚群，表明卵泡内的细胞状态和功能差异。功能富集分析揭示了特定亚群参与类固醇生物合成、卵丘扩展和细胞通讯。此外，比较成熟卵泡和非成熟卵泡揭示了细胞分布和功能差异，表明发育特异性差异。本研究结果揭示了猪窦卵泡内复杂的细胞异质性和通讯网络，为猪卵泡发育和卵母细胞成熟的调控提供了有价值的见解。这些结果对提高猪的繁殖效率和推进人类生殖医学具有重要意义。

研究结果

（1）单细胞转录组分析揭示猪窦卵泡中的三种主要细胞类型

图1：猪窦卵泡中体细胞的细胞聚集。 （A） 猪窦卵泡细胞的收集、制备和测序步骤。 （B）CellRanger鉴定的样本数据汇总。 （C） 样本的UMAP的细胞簇。 （D） 细胞类型。 （E） 细胞簇中典型标记基因的表达模式。  

（2）猪窦卵泡颗粒丘细胞分布变化

图2：样本AF75和AF76之间的视觉差异。 （A） UMAP图显示AF75（上）和AF76（下）中与卵泡闭锁和降解相关的基因表达，颜色深度与表达水平呈正相关。 （B） 主成分分析（PCA）表明O75卵母细胞为Ⅱ型卵母细胞。

（3）壁层颗粒细胞（mGC）的亚群鉴定和mGC中类固醇合成相关基因表达

图3：壁层颗粒细胞（mGC）的亚群鉴定。 （A） t-SNE图显示了mGC的四个亚群。 （B）样品AF75和AF76中的mGC细胞分布。 （C） 每个mGC亚群中有五个代表性的DEG。 （D） 每个mGC亚群DEG的KEGG功能富集分析。 （E） 与激素合成过程相关的基因表达。

（4）卵丘颗粒细胞（cGC）的亚群鉴定和注释揭示AF75和AF76之间的代谢差异

图4：卵丘颗粒细胞（cGC）亚群鉴定。 （A） t-SNE图显示cGC的五个亚群。 （B） 样品AF75和AF76中cGC的细胞分布。 （C） 每个cGC亚群有五个代表性的DEG。 （D） 每个cGC亚群中DEG的KEGG功能富集分析。 （E） 卵丘扩展（cumulus expansion）、缝隙连接(gap junction)和葡萄糖代谢（glucose metabolism）相关基因表达。  

（5）颗粒细胞亚群间的细胞通讯

图5：颗粒细胞不同亚群之间的细胞通讯。 （A） AF75（左）和AF76（右）中不同颗粒细胞亚群之间的双向通讯。 （B） 关键分子促进了AF75（左）和AF76（右）中mGC和cGC亚群之间的通讯。 （C） AF75（上）和AF76（下）中EFG、NOTCH和WNT信号通路传导。

研究结论：

本研究重点是表征猪卵巢窦卵泡内体细胞的分子和细胞特征，从而鉴定出壁层颗粒细胞和卵丘颗粒细胞内的离散亚群。分析结果揭示这些亚群之间的细胞间通讯广泛，表明它们协同参与了卵泡发育的复杂过程。此外，对两个卵泡的比较分析显示，细胞分布和功能存在差异，可能与不同的成熟状态有关。本研究结果极大促进了对颗粒细胞异质性的理解，并阐明它们对卵泡发育协调的关键贡献。

参考文献：Chen, N.; Zhang, Y.; Tian, Y.; Wu, S.; Gao, F.; Yuan, X. Deciphering Cellular Heterogeneity and Communication Patterns in Porcine Antral Follicles by Single-Cell RNA Sequencing. Animals 2023, 13, 3019. https://doi.org/10.3390/ani13193019