2014年发表在NATURE上的综述文章:诱导多能干细胞在研究和治疗中的前景
The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy - PMC (nih.gov)
上部分翻译如下:
摘要
干细胞生物学领域因重编程技术的惊人发展而突飞猛进。通过异位共表达重编程因子恢复体细胞多能性的能力为模拟人类疾病创造了强大的新机会,并为个性化再生细胞治疗提供了希望。在这一领域飞速发展的同时,一些研究人员正在暂停,以评估诱导多能干细胞是否确实是胚胎干细胞的真正等价物,以及这些细胞之间的细微差异是否可能影响其研究应用和治疗潜力。
背景
经过十年的限制,多能干细胞生物学现在是一个蓬勃发展的研究领域,继实现了一个长期的雄心壮志-从患者细胞中成功衍生出多能干细胞。2006年,高桥和田中(Takahashi and Yamanaka)阐述了转录因子异位共表达是如何改变细胞命运的,这是一项重大贡献。通过重编程对细胞命运的操纵改变了关于细胞身份稳定性的基本观点,刺激了人类疾病建模研究的主要新方向,体外组织分化和细胞转分化。尽管取得了令人振奋的进展,但仍然存在一个主要问题:新的诱导多能干细胞是否等同于经典的胚胎干细胞,因此是研究和治疗的合适替代品?虽然第一批论文令人信服地认为这两种细胞类型在功能上是等效的,但对iPS细胞在体外的行为进行更精细的分析,再加上全基因组遗传学和表观遗传学分析,揭示了许多微妙但实质性的分子差异,可能是由于重编程固有的技术限制。在这篇综述中,我们描述了诱导多能干细胞的起源,概述了多能干细胞的功能评估,然后叙述了基因表达、基因拷贝数变异、DNA甲基化和染色质修饰的整体评估如何提供对诱导多能干细胞和胚胎干细胞更精细的比较。我们详细介绍了这些特征如何影响每种细胞类型在疾病建模和治疗中的效用,并预测了体细胞重编程技术的进化。
多能干细胞
自 Takahashi 和 Yamanaka 的突破以来,已有大量论文大力赞扬重编程技术的进步,包括重编程的替代方法和从各种细胞类型成功衍生 iPS 细胞。尽管该领域已经以惊人的速度发展,研究人员最近已经后退一步,更严格地评估iPS细胞相对于ES细胞,并努力充分了解这些细胞群体之间的差异,希望缩小两个群体之间的差距。从数据中获取线索,研究人员似乎应该尝试更准确地定义每种细胞类型并了解其固有特性,而不是询问这两类多能细胞是否相同。尽管 ES 细胞和 iPS 细胞在所有功能上都可以说是等效的,但由于它们不同的起源和衍生模式,这些细胞必然存在细微的差异,并且在研究中具有不同但互补的作用。要了解 ES 细胞和 iPS 细胞之间的差异,我们必须首先定义多能性的含义。
多能性一词已被分配给具有广泛功能能力的多种细胞类型。从最宽松的意义上说,多能细胞描述了一种细胞,它可以从三个胚胎胚层中的每一个生成细胞类型:内胚层、中胚层和外胚层。然而,在定义范围的严格意义上,多能细胞描述了一种可以产生整个生物体的细胞,在该生物体中产生每种细胞类型。细胞多能性的特性由 Driesch 于 1891 年首次揭示,当时他将早期海胆囊胚的两个细胞分开,并观察到两个完整海胆的发育。几十年后,Mintz 及其同事 3、Gardner4 和 Brinster5 在 1960 年代和 1970 年代对胚胎聚集和囊胚嵌合的研究,巩固了小鼠囊胚内细胞团的细胞是多能性的想法。1981年,Evans、Kaufman6和Martin7分离出小鼠畸胎瘤干细胞和天然胚胎干细胞,开创了在培养皿中培养多能干细胞的时代。1998年,汤姆森及其同事首次成功分离出人类胚胎干细胞,这在科学界和其他领域引起了极大的兴奋8。研究胚胎干细胞,为在体外了解人类早期发育、组织形成和分化的潜力似乎提供了无限的可能性。建立疾病模型、发现疾病机制以及最终对以前无法治疗的疾病使用细胞疗法的机会尤其诱人。
然而,从人类胚胎中提取 ES 细胞在美国引发了争议,并导致了一项限制政府资助的总统行政命令9。批准用于研究的干细胞系数量有限,缺乏解决一些最引人注目的问题所必需的多样性,特别是与建模和治疗疾病相关的问题10。大多数 ES 细胞代表从可能正常的胚胎中分离出来的通用细胞——除了那些来自已经通过植入前诊断测试并被发现携带遗传疾病的胚胎。这些通用细胞系可能与特定患者不匹配,因此从它们衍生的用于移植目的的产品将面临移植接受者免疫系统的排斥反应,或者需要接受者接受有毒免疫抑制药物的终身治疗。使这些限制复杂化的是,当人类ES细胞培养在小鼠饲养层细胞上时,人类细胞可能会掺入使ES细胞遭受免疫排斥的老鼠成分。
为了充分发挥ES细胞的潜力,研究人员预见到,通过体细胞核移植(SCNT)将产生针对每个患者的定制、个性化的多能干细胞-这种方法已经成功地从成年乳腺细胞中克隆了多利羊。核移植产生的胚胎干细胞(ntES)细胞系将捕获患者细胞中的完整基因组,这些基因组可以被诱导成为任何组织,从而能够分化成与疾病相关的细胞,用于分析或细胞替代治疗。尽管在小鼠实验中成功地证明了原理11,而且为医学研究创造ntES细胞和创造用于繁殖的克隆胚泡之间存在明显的区别,但由于普遍反对克隆人类而引发的伦理争议严重限制了对人类SCNT的研究。直到今年,当研究人员获得大量人类卵母细胞时,才完成了通过人类SCNT获得多能干细胞的工作。然而,这项研究中的研究人员需要保持卵母核完整才能获得多能干细胞,因此得到的细胞是三倍体,从而为这些细胞提供了研究应用,但限制了它们用于治疗的适用性12。
尽管在过去的十年中,人类ES和ntES细胞的研究和衍生遇到了许多障碍,但在理解调控ES细胞维持和多能性的途径方面取得了长足的进步。对于那些寻找个性化患者特有干细胞的替代来源的人来说,这一进展并未被忽视。2006年,Takahashi和Yamanaka宣布,通过异位共表达仅四个基因,能成功地从成年小鼠成纤维细胞中衍生出iPS细胞。在对24个候选基因的精细筛选中,这些研究人员发现了四个足以将成人成纤维细胞重新编程为iPS细胞的因素:OCT4(也称为POU5F1)、SOX2、Krüppel-like factor4(KLF4)和c-MYC。这一历史性的贡献引发了一系列令人震惊的后续研究,成功的重编程很快被转移到人成纤维细胞13-15,然后转移到各种其他类型的细胞,包括胰腺β细胞16、神经干细胞17、18、成熟B细胞19、胃和肝细胞20、黑素细胞21、脂肪干细胞22和角质形成细胞23,证明了似乎普遍存在的改变细胞特性的能力。
小鼠的iPS细胞和人类的iPS细胞在外观上不同。小鼠iPS细胞克隆比人iPS细胞克隆更具圆顶状和折光性。人的iPS细胞集落比小鼠的克隆更平坦,类似于一种独特的多能干细胞,这种干细胞来自小鼠早期胚胎的上胚层24,这一特征表明,鼠和人的iPS细胞,如鼠和人的ES细胞,可能反映不同的发育状态(图1)。小鼠干细胞的多能性状态被称为“原始(naive)”状态,因为它与小鼠内细胞团的最原始状态或基本状态非常相似;这不同于人类干细胞更“原始”的状态,后者对不同的细胞因子做出反应而增殖,反映了这些群体的不同发育状态。无论采用何种方法,iPS细胞都保持了ES细胞的主要特征,包括在培养中无限期繁殖的能力,以及从三个胚胎胚层中的每一个产生细胞的能力(见参考文献26)。如此广泛的相似性并不能证明iPS细胞在分子或功能上等同于ES细胞。Yamanaka的意图是获得一种替代的多能干细胞来源,具有与ES细胞相同的功能,但提供更大的临床应用潜力。为了确定通过重新编程获得的成功程度,我们必须探索一套评估ES细胞的关键特征,即多能性的分析方法。
图1|多能干细胞类型的形态。小鼠ES(A)和iPS(B)细胞形成圆顶状的屈光集落。这些集落与小鼠上皮细胞来源的干细胞(F)的扁平形态形成对比,后者类似于人类的ES(D)和iPS(E)细胞。化学抑制剂97-100(C)诱导人iPS细胞进入原始多能状态,其形态与小鼠ES细胞和iPS细胞相似。比例尺,50μm。
对多能性的评估
在过去的几年里,鉴定和评估iPS细胞及其与ES细胞的功能等价性的一致标准已经被广泛接受。已经开发了各种重新编程方法来获得iPS,每种方法都有优缺点(表1)。评估重编程始于确定具有明显边界和明确边缘的致密克隆,并且由具有大细胞核、大核仁和稀少细胞质的细胞组成。重新编程产生了广泛的集落形态,尽管许多集落看起来在形态上类似于ES细胞,但只有其中的一部分具有类似的分子和功能特征。为了准确区分重新编程的、真正的iPS细胞和那些仅部分重新编程的细胞,研究人员寻找一系列分子特征。
多能性标记物
完全重新编程的细胞表达包括OCT4、SOX2和NANOG在内的多功能基因网络,其水平与ES细胞相当,它们重新激活端粒酶基因表达,下调THY1和上调SSEA1(参考28)。碱性磷酸酶染色阳性被广泛用作多能性的标志;然而,最近发表的数据表明,这不足以作为真正的iPS细胞的测试,因为中间重编程细胞也染色阳性29。同一报告显示,当内源性多能基因被激活时,由病毒介导的重编程产生的iPS细胞沉默前病毒基因,并且伴随着胚胎抗原SSEA3、TRA-1-60、TRA-1-81、DNA甲基转移酶3β(DNMT3β)和REX1的表达(Ref29)。全基因组的表观遗传重编程对于产生完全重编程的细胞至关重要,成功程度的衡量部分是通过评估负责维持多能性的基因启动子的甲基化状态以及对驱动分化重要的基因30来衡量的。表观遗传重编程过程中的一个关键事件是沉默的X染色体的重新激活,它发生在重编程的后期,代表了基态多能性的标志28、30、31。如果iPS细胞获得了所有这些分子特征,它们将表现得像ES细胞一样,并表现出重编程因子的独立性,这是以沉默前病毒转基因为标志的。表观遗传重编程的变化、甲基化程度、整合前病毒的持续表达以及其他已知和未知因素都会改变iPS细胞的分化潜能。由于潜在的异质性,在标记一个细胞系具有多能性之前,尽可能多地了解它的性质是至关重要的。
多能性的功能分析
当iPS细胞系被分离并记录为携带完全重编程的细胞的分子特征时,它们通常也会在功能分析中进行评估。IPS细胞功能的鉴定始于体外分化。这些细胞可以分化为拟胚体--组织松散的致密球状组织,类似于原肠期胚胎--或者通过在培养皿中进行二维定向分化。然后,可以对这些培养物进行评估,以确定三个胚层中每一个的标记。小鼠细胞多能性的分析通常需要进行嵌合体发育测试,以评估iPS细胞在注射到囊胚后对成体组织正常发育的潜力。种系传播是否发生在囊胚嵌合体之后是通过嵌合体在其后代中产生all-iPS-细胞小鼠的能力来衡量的。这些后代具有注射的iPS细胞系的基因组完整性,以及形成功能生殖细胞的能力。对小鼠iPS细胞的最严格测试-四倍体互补-需要将iPS细胞注射到四倍体囊胚中,以衡量iPS细胞指导整个生物体正常发育的能力。这项测试仅在iPS细胞32-34的有限细胞集上完成,尽管其效率与ES或NTE细胞33、35、36进行的四倍体互补类似。
目前人类iPS细胞的功能金标准包括对畸胎瘤形成的评估。在这项试验中,将人iPS细胞注射到免疫缺陷小鼠37,38皮下或肌肉内后,测量其体内分化潜力。如果这些细胞真的具有多能性,它们将形成分化良好的肿瘤,这些肿瘤由三个胚层组成。该检测提供了注射的iPS细胞的自发分化潜能的信息。虽然这是对人类iPS细胞可用的最严格的测试,但它不足以评估iPS细胞是否能产生人体所有类型的细胞,也不能评估iPS细胞对生殖系的贡献。对所有这些功能分析的警告在于,iPS细胞的标准仍然存在激烈的争论,特别是在预期iPS细胞用于治疗39的时候。随着干细胞研究和应用的发展,采用一套可以在全球范围内统一应用的一致标准是至关重要的。
iPS细胞和ES细胞的功能差异
尽管有大量用于评估多能性的分析方法,并且虽然在 iPS 细胞和 ES 细胞之间发现了许多相似之处,但仍有大量证据表明这些细胞类型之间存在细微而实质性的差异。在畸胎瘤形成和体外分化试验中,首次观察到 iPS 细胞和 ES 细胞的分化能力存在差异。一些小鼠 iPS 细胞的畸胎瘤形成效率低于小鼠 ES 细胞,而一些人类 iPS 细胞的沿造血、神经上皮和神经元谱系分化时比人类 ES 细胞表现出较少的倾向。一些研究人员将这些发现解释为 iPS 细胞本质上比 ES 细胞具有更低的分化能力,而其他研究小组提供了不同的解释,包括来源细胞可能对衍生 iPS 细胞的分化能力具有特定影响。
细胞来源研究的结果表明,亲代细胞可以影响所得 iPS 细胞的分化能力。在一项研究中,小鼠骨髓来源和 B 细胞来源的 iPS 细胞显示出比成纤维细胞来源的 iPS 细胞或神经祖细胞来源的 iPS 细胞系更有效的造血谱系分化。有趣的是,用曲古抑菌素 A(一种有效的组蛋白去乙酰化酶抑制剂)和 5-氮杂胞苷(一种耐甲基化的胞嘧啶类似物)处理神经祖细胞衍生的 iPS 细胞增加了这些细胞的造血能力,这表明它们的局限性是由于表观遗传修饰。虽然骨髓来源和神经祖细胞来源的 iPS 细胞对嵌合体测定中的所有组织(包括生殖系)都有很好的贡献,但成纤维细胞来源的 iPS 细胞的贡献却很差 43。这项研究为后来探索 iPS 细胞和 ES 细胞之间的分子差异的研究路线奠定了一些早期基础,并为这些细胞之间的功能差异提供了解释。
一项调查发现,与来自其他组织的 ES 细胞或 iPS 细胞相比,一些源自人类视网膜色素上皮细胞的 iPS 细胞显示出更高的分化回这种细胞类型的倾向44。最近,Bar-Nur 及其同事表明,从人胰岛β细胞产生的iPS细胞在关键β细胞基因的位置保留了开放的染色质,这与其能在体内和体外比ES细胞或同基因型的非β细胞来源的iPS细胞具有更强分化为胰岛素产生细胞的能力有关。这些功能差异超出了疾病建模的分化和效力。例如,脆性 X 综合征是由人类发育过程中 FMR1 基因的异常沉默引起的;从患有脆性 X 综合征的个体的成人皮肤成纤维细胞重编程的 iPS 细胞未能重新激活 FMR1 基因,而通过植入前测试诊断出来自患有该综合征的胚胎的 ES 细胞表达 FMR1(参考文献 46)。因此,在研究这种情况和可能的许多其他情况时,必须考虑脆性 X 综合征衍生的 iPS 细胞中表观遗传记忆的潜力,以及脆性 X 综合征衍生的 iPS 和 ES 细胞之间的实质性差异。为了确定所使用的多能细胞是否适合解决特定问题或用于特定应用,不仅要比较体内和体外分化潜能,还要比较支撑这些功能差异的遗传和表观遗传差异。 .
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