新冠疫苗的开发在抗击冠状病毒病大流行方面取得了非凡的进展。然而，新变种的出现、病毒的快速传播和全球不断出现的感染浪潮依赖给我们带来了巨大的挑战。目前仍然迫切需要开发新的抗病毒工具来控制病毒传播和加强疫苗接种工作。
近日，致力于研发RNAi疗法的奥尼兰姆制药公司(Alnylam Pharmaceuticals)在bioRxiv杂志上发表了一篇名为“Robust and durable prophylactic protection conferred by RNA interference in preclinical models of SARS-CoV-2”的报道。
RNA干扰(RNAi)是一种高度保守的自然机制，利用具有细胞机制的siRNA来催化靶信使RNA(mRNA)或病毒RNA(vRNA)的序列特异性下调。经过近二十年的努力，基于RNAi的疗法已成为一类新的药物，其中有四种已获批准的药物和处于不同临床研究阶段的其他药物。此外，最新进展表明，2'-O-棕榈酰(C16)与鼻内(IN)递送siRNA的结合允许细支气管和肺泡的摄取，导致了肺中RNA的持久沉默。这一结果提示有机会在病毒复制的主要位点用siRNA靶向SARS-CoV-2基因组的高度保守区域，从而实现广泛而直接的抗病毒策略。此外，RNAi 方法可能对免疫功能低下的患者有效。
siRNA的设计和筛选
该研究评估了2020年初可用的SARS-CoV、SARS-CoV-2和中东呼吸综合征(MERS-CoV)基因组的保守序列，并确定了SARS-CoV-2和SARS-CoV基因组之间的1511个完全保守位点以及SARS-CoV-2和MERS-CoV基因组之间的9个保守位点。研究者选择了预测适合RNAi的349个独特靶序列的子集，并将相应的siRNA合成为C16偶联物以供进一步评估。使用两个双荧光素酶报告载体评估通过转染的初始体外活性，其中(+)链RNA SARS-CoV-2靶位点以串联排列的形式插入海肾荧光素酶(rLuc)的3' UTR，而萤火虫荧光素酶(fLuc)作为对照。
此外，还评估了一小部分靶向开放阅读框1 ab(ORF1ab)处的(-)链RNA的siRNA。该报告基因检测鉴定了91种siRNA，与模拟转染对照相比，靶点减少≥80%。具有最高活性的siRNA位点遍布病毒基因组。使用未灭活的SARS-CoV-2在体外感染试验中评估了表现最好的siRNA。23个siRNA在10 nM时显著降低了病毒RNA，4个siRNA 在最低测试浓度0.1 nM时就能显著降低病毒RNA。但是，靶向(-)RNA基因组的siRNA在活病毒检测中均未显示出活性。靶向ORF1ab的两个siRNA候选物显示出有效的剂量依赖性抗病毒活性，COV-siRNA1和COV-siRNA2的EC50值分别为42 pM和86 pM。
双siRNA组合可防止新冠逃逸突变体的出现
使用体外病毒连续传代方法确定siRNA的耐药性。SARS-CoV-2病毒在单siRNA(COV-siRNA1)或双siRNA组合(COV-siRNA1+2)存在下以5×、10×和20×EC50传代5次。使用单siRNA处理，病毒逃逸突变体在5× EC50时很明显，P4-P5有明显的EC50曲线变化。这种趋势在更高的10×和20×浓度下持续存在，其中分别在P3和P2观察到病毒逃逸突变体。与此形成鲜明对比的是，使用双siRNA组合的治疗在连续传代后继续保持活性。即使在P5时，收集的病毒仍然对COV-siRNA1治疗敏感。总体而言，这些数据表明，针对两个不同的保守位点的双siRNA组合对病毒逃逸形成了强大的屏障。
单siRNA处理后靶位点突变的识别
为了了解用单siRNA连续治疗后观察到的敏感性降低的原因，研究者对所有siRNA 结合位点的SARS-CoV-2基因组进行深度测序。单独使用COV-siRNA1的连续传代导致在COV-siRNA1靶位点出现点突变，但在COV-siRNA2结合位点没有出现。突变的程度和频率与观察到的病毒EC50变化相关。在不同剂量的单siRNA处理的突变位点上观察到同义和非同义碱基替换。用单siRNA治疗后观察到的突变在RNAi介导的活性的关键位置引入了vRNA-siRNA错配。
相比之下，当使用双siRNA组合时，任何病毒的任一siRNA靶位点均未检测到突变。研究者评估了公共数据库中可用的4,386个SARS-CoV-2序列中的COV-siRNA1+2靶序列，以确定这些位置是否出现了任何的突变——包括变体Alpha、Beta、Gamma、Delta、Kappa和Omicron。在COV-siRNA1+2 的靶位点内未观察到突变，表明这些序列在SARS-CoV-2变体中保持高度保守。这突出了采用多siRNA组合方法来靶向病毒基因组内不同位点的治疗应用的必要性。
COV-siRNA1+2保护了感染新冠的仓鼠
研究者在感染SARS-CoV-2的仓鼠模型中评估了siRNA组合的体内功效。COV-siRNA1+2 (1, 10, 30 mg/kg)在感染前7天施用。当预防性给药时，COV-siRNA1+2以剂量依赖性方式保护动物免于体重减轻。用1、10或30 mg/kg COV-siRNA1+2预处理7天的仓鼠在感染病毒后第7天分别显示出40%、87% 和 104%的体重恢复。
研究者在感染前30天用COV-siRNA1+2治疗的动物中评估了预防益处的持续时间。结果表明，仓鼠的体重减轻得到了显着保护，几乎与较短的预处理相同。耐久性与在临床前物种中观察到的其他RNAi疗法一致。
研究者还在第-7天和/或第-14天预防性治疗的动物中评估病毒负荷和肺病理学。数据显示在用COV-siRNA1+2治疗后病毒基因组和亚基因组RNA显著减少。治疗动物的肺重量也显着低于对照组，表明肺部炎症减少。对肺组织进行组织学评估，COV-siRNA1+2治疗动物中与SARS-CoV-2相关的细支气管肺泡增生、出血、炎症、合胞细胞和水肿的严重程度或发生率均降低，但胸膜纤维化除外。
总之，这些数据表明预防性COV-siRNA1+2治疗在SARS-CoV-2感染的临床前模型中提供了持久而强大的保护。
来源：Being科学 公众号
参考文献：
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