胃癌-单细胞-Dissecting transcriptiona

• 研究肿瘤（胃癌 ,GA）异质性
• 样本 9个肿瘤和3个非肿瘤样本，27 677 个细胞的转录组全scRNA-seq
• bulk RNA-seq 验证

思路：

1. ScRNA, 质控，PCA, 聚类(tSNE/UMAP), 细胞类群鉴定。【 27 677 cells。14 clusters 最终分成 9 cell lineages】
2. 提取 所有的上皮细胞epithelial cells【epithelium
   (10 411 cells, 37.6%, marked with EPCAM, KRT18 and KRT8)】
3. 对上皮细胞进行 再聚类（tSNE）。
4. 上皮细胞良恶性鉴定【5635 malignant and 4776 non-malignant】
   4.1. TCGA-STAD 数据集（tcga_RSEM_gene_tpm）+临床信息（Survival_SupplementalTable_S1_20171025_xena_sp），Tumor/Normal DEGs, Seurat::AddModuleScore, 分别计算基于top50 genes 的scores
   4.2. 根据 malignant score and non-malignant score 用 k-means clustering algorithm 进行聚类, 得到Cluster1/Cluster2.
   4.3. 聚类后的细胞，Cluster1/Cluster2 DEGs, 重新计算malignant score and non-malignant score
   repeat 4.2, 4.3 直到结果稳定。
   4.4. 分析恶性上皮与非恶行上皮中上调的基因（DEGs），并map 到tSNE上，并给出合理解释，以证明自己分对了。（作者的另一种证明方法：非肿瘤样本中的上皮细胞，有多少比例被这种方法分成非恶性细胞？96.9%）
   4.5. DEGs 后的genelist 做GSEA 分析, 分析富集到的通路，并给出合理解释。
   4.6. 作者还用CNV进行验证，4772/4776 的非恶性标签的细胞表现出低CNV， 但是 只有25%的恶性细胞标签表现为高CNV, 说明分离出来的非恶性较为可信，而基于CNV辨别GA的良恶性不太靠谱！
5. 非恶性上皮分析，作者做了拟时序分析，想要说明非恶行向恶性的转变过程。【4776 non-malignant】
   5.1. 非恶性上皮再聚类，4776 cells 分成4个上皮细胞亚群【Surface cells, Chief cells,SPEM,Neck cell】
   5.2. Chief cells,SPEM,Neck cell, 进行拟时序分析。
6. 恶性上皮分析【5635 malignant】
   6.1. 恶性上皮再聚类，5635 cells 分成5个cluster
   6.2. 基于细胞分化相关的marker, 计算分化得分 differentiation score based on KRT20 and its positive-correlated genes (ie, PHGR1,MDK,CHDR2, RARRES3,GPA33,SLC5A134 and MUC13), 并将分化得分map 到tSNE上。
   6.3. 做拟时序分析
   6.4. TCGA STAD dataset 408 patients 做基于分化得分（high-score/low-score）的生存分析
   6.5. 研究 C1,C2,C3 (classic Lauren’s histopathology types of GA)的DEGs
   6.6. 分析C4
   6.7. 分析C5
   Conclusion：我们的研究为解释胃肿瘤的异质性提供了宝贵的资源，这将帮助提供精确的诊断和预后。

Definition of malignant and non-malignant scores

Signature genes for malignant scores were selected as the top 50 highly expressed genes (adjusted p value < 0.01) in tumour tissues (the initial step) or malignant cells (the subsequent steps).

Signature genes for non-malignant scores were selected as the top 50 highly expressed genes (adjusted p value < 0.01) in normal tissues (the initial step) or non-malignant cells (the subsequent steps).

Malignant scores and non-malignant scores were calculated using the “AddModuleScore” function in “Seruat” R package.

• AddModuleScore

library(Seurat)
AddModuleScore(object = object, features = genelist,  name = "Module_Score")

其实质实际计算在每一个细胞中，感兴趣基因集表达的平均值。