近年来，由于RNA-seq等新型测序技术的出现以及基于质谱的蛋白质组学深度和通量的显著提高，蛋白质基因组学（proteogenomics）研究的步伐大大加快。随着乳腺癌、结肠癌和卵巢癌早期蛋白质基因组学研究的发布，一系列针对各种肿瘤类型的蛋白质基因组学图谱研究已经发表。这些研究系统地分析和整合了基因组、转录组、蛋白质组和PTM数据，以进一步了解疾病发病机制并确定每种肿瘤类型的治疗靶点。

2022年12月20日，圣路易斯华盛顿大学医学院丁莉(Li Ding)教授领衔，近30个合作机构合作，在Cancer Cell杂志上发表了题为：Histopathologic and proteogenomic heterogeneity reveals features of clear cell renal cell carcinoma aggressiveness 的研究论文。本项研究扩大了既往透明细胞型肾细胞癌（ccRCC）患者队列和分析，将临床蛋白质组学肿瘤分析联盟（CPTAC）ccRCC队列从213例扩展到305例，纳入包括组织病理学分析、多样本肿瘤的基因组学、转录组学和蛋白质组学分析，同时体外分析了不同靶向治疗的肿瘤特异性磷酸化蛋白质组学，并且首次揭示了ccRCC肿瘤代谢组学和糖基化蛋白质组学特征。

研究思路

研究亮点

1. 综合多组学和组织病理学揭示了 ccRCC 的肿瘤内异质性改变

2. 通过 snRNA-seq 发现侵袭性肉瘤样和横纹肌样组织学特征

3. 高分化 ccRCC 具有特异性糖质、代谢和甲基化特征

4. UCHL1 与甲基化、基因组不稳定、BAP1 突变及低生存率相关

研究结果

ccRCC组织病理学异质性的分子基础

ccRCC组织在肿瘤上皮内表现出广泛的组织病理学异质性，表现为核/核仁特征的差异，这些特征构成了临床Fuhrman分级的基础。高分化肿瘤与较高的术后疾病复发风险相关，并且与肿瘤侵袭性改变有关。为确定与组织病理学异质性相关的潜在分子变化，作者首先将213例ccRCC病例分为四种组织病理学亚型，并进行了综合多组学分析：低分化ccRCC（CL）肿瘤（G1/G2：N = 121）和高分化ccRCC（CH）肿瘤（G3 / G4：N = 92），以及CH组中的肉瘤样特征组（CH-S），横纹肌样特征组（CH-R）。鉴定了与组织病理学异质性相关的分子变化，系统地评估了嗜酸性粒细胞/颗粒变化等七个高分化形态学特征，并量化为每个肿瘤的高分化特征计数 （HGFC）。

因此本部分作者确定了与分化相关的临床和分子特征，包括Fuhrman分级，HGFC，基因组不稳定性和蛋白质组学标志物。将UCHL1蛋白表达表征为与低生存率、BAP1 突变、高wGII和特异性DNA甲基化亚型相关的预后生物标志物。同时结果显示，与低分化肿瘤相比，高分化肿瘤的肿瘤间异质性水平更高。

图1 ccRCC组织病理学异质性的分子基础

综合分析ccRCC和TME ITH表征

为了研究组织病理学特征与分子谱之间的关联，更深入地了解ccRCC ITH，作者使用来自40名患者的132个肿瘤部分组织的蛋白基因组数据，进行了综合分析。结果显示，区域组织学和蛋白质基因组学变异，包括患者肿瘤内的体细胞驱动克隆突变和基因拷贝数变异（CNV）在ccRCC中很常见，并且在形成区域TME异质性方面发挥重要作用。并且，作者通过snRNA-seq研究了来源于4个病例的12个肿瘤组织的ITH转录组，包括横纹肌样，肉瘤样，多结节性和透明质化肿瘤组织。在测序的 104，654 个细胞核中，62% 形成一个主要的肿瘤簇，其中包含病例特异性亚簇、表达与某些特征相关的肿瘤内在标志物以及病例水平的相应富集通路。38% 为 TME簇，包括T 细胞、自然杀伤细胞、B 细胞、巨噬细胞、成纤维细胞和内皮细胞等，因此作者进一步细化了肉瘤样和横纹肌样组织学相关基因表达特征以及与肿瘤侵袭性相关的组织学特征。

图2 ccRCC蛋白基因组学和TME ITH表征 图3 单细胞分析鉴定出 ITH、肉瘤样和横纹肌样表达特征 图4 snRNA-seq 图谱进一步细化肉瘤样和横纹肌样组织学相关基因表达特征

甲基化亚型I与BAP1突变和与低生存率相关

表观遗传DNA甲基化标记的失调被认为是癌变的早期事件。前期的泛RCC基因组研究显示，DNA甲基化增加与ccRCC较差预后之间存在强关联。因此作者通过扩展队列数据进行进一步探索，在肿瘤和正常邻近组织的8,000个变化最大的CpG位点（探针）中，确定了与组织病理学亚型相关的探针和相关基因。结果显示甲基化亚型I与BAP1 突变和与低生存率相关。

图5 甲基化亚型I与BAP1 突变和与生存率低相关的各种其他特征有关

磷酸化蛋白质组揭示ccRCC中磷酸化信号通路和激酶-底物相互作用的关键靶标

为了鉴定ccRCC中的关键磷酸化信号通路，作者研究了基于激酶-底物（K-S）的磷酸化信号网络。磷酸化蛋白质组学数据集包含110例基于DIA的EXP队列病例和103例基于TMT方法的INI队列病例。基于DIA和TMT磷酸化蛋白质组的分析，结果显示约80%的磷酸化底物丰度最高的K-S对（肿瘤与NATs），富集于表皮生长因子受体（EGFR）、MEK、ERK和WEE1的信号网络。此外，PRKCZ和PARD3的磷酸化呈正相关，并且两种蛋白质都参与Rap1信号通路。为了检查ccRCC肿瘤间磷酸化蛋白质组学异质性，作者进一步构建无偏倚的磷酸化蛋白质组聚类，确定了四种主要的ccRCC磷酸化蛋白质组学亚型（P1-P4）及特征。并且作者结合激酶抑制实验和ROC分析验证了MAPK信号传导的靶标，结果显示，在测试的药物中，MEK抑制剂可减少下游磷酸化底物磷酸化水平和并在低IC浓度下诱导肿瘤细胞死亡。

图6 ccRCC中磷酸化信号通路和激酶-底物相互作用的关键靶标

高分化ccRCC特异性蛋白糖基化的特征

肿瘤细胞表面蛋白的异常糖基化会影响各种生物学功能，例如细胞信号传导等。作者应用基于质谱的糖基化蛋白质组学技术分析确定了ccRCC肿瘤与 正常邻近组织 51 种上调和 131 种下调的完整糖肽 （IGP），其中，四种糖蛋白（FN1，FBLN5，BGN和TNC）的四个IGP显示出区分肿瘤和非肿瘤组织的能力，细胞外基质-受体相互作用、粘附和PI3K-Akt信号通路富集自正调控IGP的糖蛋白。另一方面，肾素-血管紧张素系统、糖胺聚糖降解和溶酶体途径富集自负调节的IGP。肿瘤中糖基化酶（包括MAN1C1，MGAT1和ST6GAL1）相对于正常邻近组织在蛋白质水平上调，可用作潜在的治疗靶点。

图7 高分化ccRCC特异性蛋白糖基化的特征

高分化ccRCC与低分化ccRCC的代谢特征

重编程的肿瘤代谢是癌症的标志，表现为代谢物丰度和组成的改变，作者通过来自50例ccRCC和7例NAT的代谢组数据定量了各种代谢途径中的183种代谢物，结果显示有 55种具有肿瘤特异性丰度的代谢物，差异代谢物富集于精氨酸生物合成，丙氨酸，天冬氨酸/谷氨酸代谢，嘧啶代谢和嘌呤代谢途径。

图8 高分化ccRCC特异性蛋白糖基化的特征

总结

本研究通过多组学分析揭示了ccRCC中存在的肿瘤间异质性。高分化肿瘤中存在特定蛋白质基因组特征的富集，包括不同的磷酸化和糖基化蛋白特征，如BAP1 突变，肿瘤高甲基化和肿瘤组织肉瘤样特征，与不良的患者预后有关。同时本研究强调了可通过IHC测量UCHL1表达，作为具有BAP1 突变，基因组不稳定或肿瘤高甲基化增加的高分化肿瘤的潜在生物标志物之一。

参考文献

[1] Mani, D. R, Krug, K., Zhang, B, Satpathy, S, Clauser, K. R, Ding, L, Ellis, M, Gillette, M. A., & Carr, S. A. (2022). Cancer proteogenomics: current impact and future prospects[J]. Nature reviews Cancer, 22(5):298–313.

[2] Li Y, Lih TM, Dhanasekaran SM, An E, et al. Histopathologic and proteogenomic heterogeneity reveals features of clear cell renal cell carcinoma aggressiveness[J]. Cancer Cell,2022,S1535-6108(22):00565-7.