自2009年首篇单细胞测序文章的发表、2013年《Science》将单细胞测序技术列为年度最值得关注的技术榜首以来，单细胞测序技术在这十几年间不断地发展，特别是近几年，单细胞测序技术得到了爆发式的发展与普及，已然成为研究者们的基础研究利器。那么，单细胞转录组测序技术（scRNA-seq）相较传统的转录组测序到底有着什么优势和特点呢？
接下来，我们就以当前应用最广泛的10x Genomics 3’单细胞转录组测序技术为例，依次从技术概况、核心原理&实验流程、数据分析策略、应用领域及案例、样本准备及运输注意事项等方面，为您详细介绍和解析单细胞转录组测序技术。
技术概况
什么是单细胞转录组测序技术？
细胞异质性是生物组织的普遍特征。由于传统的转录组测序(RNA-Seq)技术的测序水平是在个体或群体水平上对数万个细胞进行转录组测序，因此传统转录组测序技术的测序结果就只能检测到个体间或者群体间的转录组差异，而细胞间的转录差异则无法精确地检测到。而单细胞转录组技术则提供了一种在单个细胞水平进行高通量转录组测序的一项新技术，能够有效解决细胞间转录组异质性以细胞群间转录组异质性的难题。
百奥智汇10x Genomics 3’单细胞转录组测序采用10x Genomics最新的Chromium平台，能够在单个细胞水平对mRNA进行高通量测序。该技术具有高通量、高精准度特点，能够一次性分离数百至数万个细胞，将分离细胞中的微量mRNA高效扩增后测序。目前，该技术已在生殖、免疫、干细胞分化、肿瘤异质性、神经系统发育、脑发育等多个研究领域得到广泛应用，以评估肿瘤异质性和干细胞组成，剖析神经元群体、细胞表型分析、鉴定新的疾病靶点和生物标志物、追踪细胞谱系、分析细胞状态动态转化等。
核心原理&实验流程
10x Genomics单细胞转录组测序技术如何在单细胞维度上获取基因表达信息？
单细胞转录组测序的显著优势在于能够在单细胞水平上对细胞转录组进行测序，即在更高分辨率的水平下对细胞的差异表达进行检测。因此，该技术的核心在于能够成功区分样品中的不同单细胞转录本。10x Genomics平台利用微流控技术，结合Barcode-单细胞-油滴的对应关系，最终得到了捕获单个细胞的“胶珠”，实现了真正意义上的单细胞测序。
该方法的基本实验流程包括细胞悬液制备，加条码和文库构建、高通量测序、数据分析和可视化报告。使用该平台前先要对样本进行解离，以制备符合上机要求的单细胞悬液。在完成细胞悬液的制备后，即可将悬液和建库试剂加入芯片，然后上机。该仪器基于微流控技术，能将单个细胞与带有条形码和引物的凝胶珠包裹到微液滴中，完成单个细胞的捕获。单个细胞捕获完成后，在微液滴中进行细胞裂解，再通过逆转录得到cDNA并扩增，最后进行高通量测序。
图2 单细胞转录组测序的基本流程
该方法的核心在于凝胶珠的设计——每个凝胶珠上包含数十万条探针，这些探针由TruSeq Read 1、10x Barcode、UMI及Poly（dT）VN组成，分别用于结合测序时所需要的引物序列、区分不同微液滴中的单个细胞、区分同一细胞中不同的mRNA序列以及捕获细胞中的mRNA。最终测序所得的序列将根据10x Barcode及UMI序列来对不同的单细胞和同一细胞中不同的mRNA序列进行区分，最终得到单细胞分辨率下的表达谱。
图3 10x Genomics Gel Beads结构与微流控技术
数据分析策略
如何分析单细胞转录组数据？
单细胞转录组测序的一般流程包括细胞质控、批次评估/校正、降维聚类、分群注释、差异表达、富集分析、拟时分析、细胞间相互作用分析和其它深度分析。其中，细胞质控是为了剔除低质量的细胞；批次评估/校正是为了去除批次效应对数据的扭曲；降维聚类是为了将数据转变为低维可视化结果；分群注释是为了对细胞类型进行鉴定以找出特异性的细胞类型；差异表达是为了获得细胞类群间/不同分组间的差异表达/特征基因；富集分析是为了揭示特定细胞亚群参与的生物学过程，确定其生物学功能；拟时分析能够揭示细胞亚群间在时间上的动态变化和前后发育关系；细胞间相互作用分析能够了解某一细胞亚群是通过哪些受配体、影响哪些其它细胞亚群来行使其生物学功能的。此外，还有一些深度分析方法可根据特定研究目的进行设计和使用。
图4 单细胞转录组数据分析的基本流程
应用领域
肿瘤治疗和免疫系统发育等领域
单细胞转录组测序为我们提供了一个在单细胞分辨率上研究细胞基因表达图谱的研究工具。截至目前，该技术已在评估肿瘤异质性和干细胞组成，剖析神经元群体、细胞表型分析、鉴定新的疾病靶点和生物标志物、追踪细胞谱系、分析细胞状态动态转化等研究领域的研究中发挥重要作用。接下来我们以两个典型例子来说明该技术在具体研究中的应用。
应用实例1：
精细刻画结直肠癌肿瘤微环境
2020年4月16日，张泽民教授团队在Cell上发表了题为“Single-Cell Analyses Inform Mechanisms of Myeloid-Targeted Therapies in Colon Cancer”的研究论文。该研究通过10x Genomics scRNA-seq和Smart-seq2两种不同的单细胞转录组测序技术，对患者肿瘤微环境中的各类细胞进行分析，揭示了各类细胞的特征、谱系发育情况及相互作用情况，深刻地揭示肿瘤微环境中的细胞异质性。基于上述结果，进一步利用小鼠模型的单细胞测序揭示了两种靶向抗癌药物的作用机制。
图5 结直肠癌中髓系免疫细胞发育路径
图6 两种单细胞测序方法得到的细胞分群及精细分群
该研究通过使用两种单细胞技术对结直肠癌患者的肿瘤微环境，特别是浸润髓系细胞类群进行了系统性的刻画，分析了TAM（肿瘤相关巨噬细胞）和DC（树突状细胞）细胞的类群特征、谱系发育及其与T细胞的其他细胞间相互作用关系。基于以上结果，分别对接受anti-CSF1R抑制剂和anti-CD40激动剂的小鼠模型进行单细胞测序，揭示了这两种靶向髓系细胞的免疫治疗策略潜在的作用机理，从而为靶向肿瘤微环境的肿瘤免疫治疗提供了更详细的理论基础。
应用实例2：
免疫系统图谱的绘制
人体妊娠期的免疫系统在多个部位同时发育。在肝脏和骨髓成为主要造血部位之前，免疫细胞依次由胚胎外卵黄囊祖细胞和主动脉-性腺-中肾区的造血干细胞（HSCs）分化。造血部位免疫细胞会发育为胸腺、脾脏、淋巴结等淋巴器官和外周非淋巴器官。然而，目前我们对妊娠期免疫系统的发育或妊娠期不同免疫器官的相互影响的具体情况仍不明了。
2022年5月12日，来自剑桥大学威康桑格研究所的研究团队在Science上发表题为“Mapping the developing human immune system across organs”的文章，基于scRNA-seq、scVDJ-seq和空间转录组分析构建了发育中的人类免疫系统，对妊娠中期的各类免疫细胞的转录组变化进行了表征。此外，研究还发现全系统的血液和免疫细胞的发育超过了传统的初级造血器官，并基于TCR基因的使用和体外人工胸腺组织培养，为αβTCR非常规T细胞的选择起源提供了证据。
百奥智汇已对该研究进行了详细解读，更多细节请点击：文献解读 | 绘制发育中的人体免疫系统跨器官图谱。
图7 发育中的人类免疫系统的细胞分群
样本准备及运输注意事项
如何准备一个合格的单细胞转录组样本？
目前，百奥智汇可承接基于10x Genomics的单细胞转录组实验和分析，接收多种类型的样本，包括组织、血液和细胞等。良好的样本准备流程及运输过程对该实验的成功至关重要，因此我们总结了一些样本准备流程和运输注意事项，希望能够对大家的课题研究提供帮助。
样品准备
新鲜组织：取至少250 mm3体积的样品量，使用1640培养基、PBS缓冲液或生理盐水清洗2-3遍（也可以根据自己组织的情况，选择适宜培养基清洗；对于肿瘤等不易沾染血液的组织也可以不清洗）。在30分钟内完成对样品的初步处理后，置于5 mL的组织保存液（美天旎），组织需要完全浸没于组织保存液中。保存液需提前置于4℃中预冷。
新鲜血液：取至少3mL体积的样品量，迅速置于EDTA抗凝管中4℃保存。
消化细胞悬液、细胞系：取至少5×105个细胞（可根据细胞浓度计算），取后置于已提前4℃预冷含10%血清的PBS缓冲液中，4℃保存。
样品寄送
冰上（保持低温运输 4℃-16℃）快递至百奥智汇。
注意事项
✦组织不应直接置于液氮中，因为温差可能导致组织表面沸腾，导致鼓泡和不均匀冻结。这可能会造成组织破裂和形态损伤。
✦可用锡箔纸包裹组织放入冷冻瓶，并放入棉花填充瓶子空隙以防止运输过程中的震动造成样本损坏，注意棉花填充适量，不要挤压到样本。
✦为了防止组织样本的蒸发和脱水，速冻组织样本必须储存在密封的容器中。
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参考文献：
Tang F, Barbacioru C, Wang Y, et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell[J]. Nature Methods, 2009, 6(5):377-382.
L Zhang, Z Li, KM Skrzypczynska, et al. Single-Cell analyses inform mechanisms of myeloid-targeted therapies in colon cancer[J]. Cell, 2020, 181(2):442-459.e29.
Suo C, Dann E, Goh I, et al. Mapping the developing human immune system across organs[J]. Science, 2022: eabo0510.
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