导读
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宏基因组分箱(Binning)是将宏基因组测序得到的混合了不同生物的序列或序列组装得到的contigs按物种分开归类的过程,类似下图[1]。传统的单物种全基因组序列都是经纯培养之后,再进行全基因组de novo测序才获得的,但是环境中存在着大量的不可培养微生物,宏基因组分箱技术有助于获得不可培养微生物的全基因组序列,获得新物种的基因组序列和功能,预测未知物种的培养方法等等。
分箱.png
一、分箱工具盘点
- 早在2011年,science上的一篇文章就用了宏基因组Binning技术对来自牛瘤胃的样本进行了宏基因组测序研究。该研究从268 Gbp的宏基因数据中成功Binning出了15个不能培养的微生物的全基因组序列(可见分箱对数据量要求很大)。从那以后,宏基因组Binning技术开始被更多的人关注和重视,也逐渐出现了很多宏基因组Binning工具。查了一些文献和资料,我罗列了一下近几年的分箱工具,引用量仅供参考(google学术,2019.8.29)。
分箱工具 | 发表杂志 | 发表时间 | 引用量 |
---|---|---|---|
ProxiMeta | Genome Biology | 2019 | 1 |
MetaBAT2 | PeerJ | 2019 | 4 |
MetaWRAP | Microbiome | 2018 | 14 |
DAS Tool | Nature Microbiology | 2018 | 59 |
Binning_refiner | Bioinformatics | 2017 | 13 |
COCACOLA | Bioinformatics | 2017 | 56 |
CoMet | BMC Bioinformatics | 2017 | 4 |
MetaBAT | PeerJ | 2015 | 465 |
MaxBin 2.0 | Bioinformatics | 2015 | 211 |
VizBin | Microbiome | 2015 | 110 |
Anvi’o | PeerJ | 2015 | 279 |
CONCOCT | Nature Methods | 2014 | 429 |
GroopM | PeerJ | 2014 | 188 |
MetaCluster 5.0 | Bioinformatics | 2012 | 115 |
PhyloPythiaS | Plos One | 2012 | 99 |
二、分箱工具比较
- 2017年Nature Methods上一篇文章对宏基因组数据处理各个过程中的软件进行了评估[ Critical Assessment of Metagenome Interpretation-a benchmark of metagenomics software ]。从文章的分析结果来看,不同的方法各有优缺(下图),MaxBin2可能是相对较好的一个分箱软件。
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比较结果:
NM.png
- 加利福利亚大学在通过整合多个算法设计出了新的Binning软件DAS tool并在2018年发表在Nature Microbiology上 [ Recovery of genomes from metagenomes via a dereplication, aggregation and scoring strategy ]。集合了多个算法的DAS tool各项Binning指数要明显优于CONCOCT,MaxBin 2,MetaBAT等方法,比较分析结果如下:
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比较结果:
对不同样本来源的宏基因组数据进行分箱完成度分析.png
对模拟微生物群落进行基因组重建分析.png
- 同年,Microbiome上发表了另一个整合了多个工具的分箱分析流程MetaWRAP [MetaWRAP—a flexible pipeline for genome-resolved metagenomic data analysis. Microbiome]。
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MetaWRAP流程不仅纳入了最流行的MetaBAT、CONCOCT和MaxBin2分箱方法,还整合了质控、拼接、分箱、提炼、评估、注释等多种功能。MetaWRAP可以解决分箱分析中可能遇到的绝大多数问题,而且比较分析发现综合多个工具的MetaWRAP分箱法不仅比单个工具分箱效果好,也比同样是综合多个算法的DAS tool分箱法效果好,比较分析结果如下:
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比较结果:
完成度和污染度的比较(CAMI数据集).png
完成度和污染度的比较(水、肠道、土壤数据).png
metaWRAP重组装分箱效果更佳.png
三、分箱实战
- MetaWRAP集合的算法和工具很全很多,但是也很慢,有条件的话可以自己尝试使用MetaWRAP。[Extensive Unexplored Human Microbiome Diversity Revealed by Over 150,000 Genomes from Metagenomes Spanning Age, Geography, and Lifestyle. Cell. 2019]这篇文章提到,MetaBAT2在单样本分箱中表现最佳,也在Metawrap文章中表现不错。Metawrap看似有前途,但是存在两个缺点:1)没有独立验证;2)计算成本高。考虑到时间,下面只以MetaBAT2为例简介分箱工作流程。
1. 准备
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下面是需要的软件和数据:
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MetaBAT2分箱工具地址:
https://bitbucket.org/berkeleylab/metabat/src/master/
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CheckM分箱质检地址:
https://github.com/Ecogenomics/CheckM/wiki -
MetaBAT2测试数据地址:
https://portal.nersc.gov/dna/RD/Metagenome_RD/MetaBAT/Software/Mockup/
- 下载得到已经组装好的contigs文件assembly.fa和两个样本的bam文件。
2. 统计contig深度
jgi_summarize_bam_contig_depths --outputDepth depth_var.txt *.bam
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统计结果:
contigs深度.png -
结果说明:
第一列:contigName
第二列:contigLen
第三列:totalAvgDepth
第四列:library1.sorted.bam
第五列:library1.sorted.bam-var
第六列:library2.sorted.bam
第七列:library2.sorted.bam-var
3. 分箱(4线程,21秒)
time metabat2 -t 4 -i assembly.fa -a depth_var.txt -o metabat2/bin –v
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分箱结果:
分箱结果.png
4. 分箱评估 (4线程,32分钟)
time checkm lineage_wf -f metabat2/checkm.txt -t 4 -x fa metabat2/ metabat2/checkm/
## 评估结果保存在checkm.txt文件中。
5. 评估结果:
- 提取ID,Taxonomy,Completeness,Contamination信息:
grep 'bin' checkm.txt | sed 's/^ //' | awk '{print $1,$2,$13,$14}' | sed 's/\ /\t/g'| sed 's/\./\t/' | sort -n -k 2 | sed 's/\t/./' > test.txt
## 从checkm.txt提取
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提取结果:
分箱评估结果.png
第一列:Bin Id
第二列:Marker lineage
第三列:Completeness
第四列:Contamination
结束语
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到此就完成了两个样本的宏基因组分箱和分箱评估工作。这只是宏基因组分箱的简介,更全更详细的分箱分析可以参考MetaWRAP分析流程。
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MetaWRAP分析流程地址:
https://github.com/bxlab/metaWRAP/blob/master/Usage_tutorial.md
参考:
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