Necroptosis throws novel insights on patient classification and treatment strategies for hepatocellular carcinoma
坏死性凋亡对肝细胞癌的病人分类和治疗策略提出了新的见解
发表期刊：Front Immunol
发表日期：2022 Jul 27
影响因子：8.786
DOI: 10.3389/fimmu.2022.970117
一、背景
肝细胞癌（HCC）是一种常见的全球癌症负担，是全球癌症相关死亡的第三大原因。在过去的十年中，癌症治疗取得了令人鼓舞的进展，如手术切除、免疫治疗、靶向治疗和化学放射治疗。在实践中，为HCC患者提供了各种治疗选择，但并不是所有的方法都有疗效，这主要归因于肿瘤的异质性。
近年来，坏死作为一种潜在的新的免疫性细胞死亡方式，已逐渐成为抗肿瘤治疗的一个新兴浪潮。深入研究阐明，坏死吞噬具有独特的分子特征，被归类为非凋亡性细胞死亡，主要由PRK1、RIPK3、RIP1、MLKL等介导。坏死反应在调节癌症生物学方面的作用是复杂的，包含了肿瘤发生、癌症转移和抗肿瘤免疫。长非编码RNAs（lncRNAs）通常拥有超过200个核苷酸，不被翻译成蛋白质。越来越多的证据阐述了lncRNAs与炎症反应、免疫浸润和免疫治疗密切相关。事实上，lncRNAs也在不同层次上调节基因表达，并与程序性细胞死亡密切相关，如坏死。
二、材料和方法
1、数据来源
1） 四个公共数据库，包括TCGA-CIHC、GSE14520、GSE116174和GSE10141，共检索到728例HCC患者
2）从TCGA GDC获得体细胞突变数据
3） 拷贝数变异（CNV）数据从FireBrowse在线工具下载
4） 筛选了四个符合条件的数据集，其中有表达数据和免疫治疗信息，包括GSE35640、GSE91061、GSE100797和Nathnaon队列，共有98名无应答者和41名应答者被用来评估免疫治疗的效果
2、分析流程
流程图
三、实验结果
01 - 坏死凋亡在肝细胞癌中的作用
这项研究中提取了115个坏死相关的基因（NAGs）来探索坏死凋亡。肿瘤和正常组织之间的NAG表达具有显著差异，暗示了不同的生物学行为（图2A）。在TCGA-CIHC数据集中，来自肿瘤和正常组织的样本可以通过NAG的表达谱进行很好的区分，表明坏死吞噬作用导致了肿瘤的异质性，并可能在HCC的肿瘤发生中发挥关键作用（图2B）。很多研究已经阐明了TME与肿瘤的发生和发展有着密切的关系。因此，使用ssGSEA算法计算坏死得分，以解码与TME的串扰。较高的坏死指数显示出更有利的预后（图2C）和较高的免疫细胞浸润（图2D）。此外，坏死评分与基质评分和免疫评分都有很强的相关性，是调节TME的潜在力量（图2E，F）。与常见的免疫检查点如CD274和CTLA4也呈现显著正相关关系（图3A）。所有上述结果表明，坏死性凋亡与TME有密切的联系，并可能对肿瘤的发生有明显的影响。
图2 肿瘤微环境（TME）中坏死的作用
02 - 筛选坏死相关的长非编码RNA并发展出异质性的亚型
为了进一步解读肿瘤的异质性，本研究通过WGCNA方法鉴定了坏死凋亡相关的lncRNA（NALRs）。首先，对样本树状图和性状热图进行可视化，然后去除离群的样本进行聚类。然后，通过聚类树枝图和eigengene邻接热图，对样本进行切割和聚类，得到了8个共表达模块（图3B，C）。此外，还评估了基因模块和坏死评分之间的关系。其中，绿色模块显示出与坏死表型的最强联系（图3D）。基因模块的稳健性最终通过基因重要性（GS）和模块成员（MM）之间的相关分析进行了测试（图3E），显著的R值表明了它们之间存在强相关，绿色模块基因被定义为NALRs，用于后续分析。
图3 鉴定坏死相关的lncRNAs
利用单变量Cox回归分析，共筛选出57个预后相关的NALRs，用于探索HCC异质性（图4A）。根据NALR的表达，采用共识聚类分析来破译异质性亚型，其中所有HCC患者最初被分配到k（k=2-9）个聚类。较高的共识分数意味着更有可能划分到同一亚组（图4B）。同时，CDF曲线的中间段更平滑，代表更清晰的样本分配。所有的结果表明，当k = 2时产生了最佳的聚类数。此外，PAC也被普遍用于通过量化中间段来评估无监督聚类。当样本被分配到两个聚类中时，PAC呈现出最低值，意味着k=2又是最好的（图4C）。为了进一步确定稳定和稳健的亚型，通过测量剪影系数和筛选正剪影宽度来检测样本（图4D，E）。
图4 通过共识聚类发展肝细胞癌（HCC）的坏死亚型
本研究确定了两种坏死性亚型：C1和C2。为了提高临床效用，进一步阐明了亚型的预后价值。结果显示，C2在OS和RFS水平上都显示出较差的预后（图5A，B）。潜在的生物学特征可能会映射到不同的临床结果上；因此，采用Hallmark通路解读C1和C2的潜在生物学行为。C1的患者主要富含免疫炎症途径，如干扰素-γ反应和炎症，而C2的患者明显与代谢和增殖活动有关（图5C）。因此，C1被定性为免疫炎症性HCC，C2被定义为细胞增殖性和代谢性HCC升高。
此外，比较了以前的免疫相关的分子亚型，桑基图描绘了 HCC 患者对免疫亚型的坏死性凋亡亚型样本贡献。坏死性亚型C1和C2分别与免疫亚型C3和C4有紧密联系。与以前的研究结果一致，免疫亚型C3在OS和无进展生存（PFS）水平上都呈现出最有利的预后（图5D，E）。综上所述，两种坏死亚型具有着重要的预后价值。
图5 坏死亚型的预后意义
进一步检索了三个来自不同平台的独立的外部数据集来验证坏死性亚型，包括GSE14520、GSE116174和GSE10141数据集。根据特征基因的表达，利用NTP的方法来探索坏死性亚型的稳定性和可靠性。使用WGCNA将软阈值β设定为5时，特征基因被过滤掉。根据最明显的模块，粉色和红色的成分分别被定义为C1-和C2-特异性特征基因。在对预测置信度进行量化和评估后，提取了错误发现率（FDR）小于0.05的样本进行后续调查（图6A，C，E）。所有的KM分析都阐述了C2在GSE14520（图6B）、GSE116174（图6D）和GSE10141数据集（图6F）中仍然呈现出糟糕的OS。结果通过严格的验证证明了坏死亚型的稳定性和预后价值。
图6 通过最近的模板预测（NTP）方法验证坏死亚类
03 - 独特的分子和临床特征
如图7A所示，作者探讨了体细胞突变的情况，并在HCC患者中鉴定了前20个频繁突变基因（FMG）。值得注意的是，在常见的FMGs中，C2的突变频率明显高于C1，尤其是TP53、CTNNB1、TNN和CACNA1E（图7B）。虽然有些突变没有统计学上的差异，但C2有明显的高突变频率的趋势，如PCLO和PROKDC（图7B）。为了进一步剖析基因组变异，在不同的坏死亚型之间比较和评估了碱基、片段和染色体臂的CNV（图7C，D）。C2出现了明显的CNV，并且在碱基、片段和染色体臂水平上有更多的缺失（图7C，D）。对于扩增的改变，C2也表现为在碱基和片段上有更多的负担，但不包括染色体臂水平（图7C，D）。在体细胞突变和CNV方面，与C1相比，C2拥有更高的负担，包括TMB、非整倍体分数和HRD（图7E-G）。综上所述，C1被认为是一个稳定的基因组亚型，而C2的特点是基因组高度不稳定。
图7 坏死亚型的基因组变异情况
作者还比较了坏死亚型之间的临床特征，包括年龄、性别和AJCC分期（图8A-C）。年龄和性别之间没有统计学意义，而C2患者的临床分期较晚，意味着表型更恶性（图8A-C）。考虑到C2的特点是细胞增殖和代谢活动升高，临床分期较高，因此进一步解释了预后不良的原因。结合这些临床特征，多变量Cox回归分析表明，AJCC分期和坏死亚型都是评估OS的独立风险指标（图8D）。类似的发现也出现在预测TCGA-CIHC数据集的RFS中（图8E）。因此，坏死亚型可能是评估HCC患者预后的一个有前途的工具。
图8 异质性坏死亚型的临床特征
04 - 肝细胞癌患者免疫治疗的综合评估
坏死性亚型在几个方面表现出明显的异质性，包括预后、基因组变异、生物学特征和临床特征。迫切需要确定最佳治疗方法并进一步促进临床结果。为了弥补这一差距，作者从以前的研究中获取了储存的28个免疫细胞的免疫基因集。与C2相比，C1倾向于 "免疫热"亚型，在TME中有更多的免疫细胞浸润（图9A）。C1也表现出27种ICP(immune checkpoint)分子的更高表达，包括B7-CD28超家族、TNF超家族和其他分子（图9B）。大量的免疫效应细胞聚集在C1亚型中，如活化的B细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞，表明有更强的抗肿瘤杀伤能力（图9C）。此外，相对于C2，共刺激和共刺激ICPs在C1中普遍高表达（图S4A，B）。所有这些免疫细胞浸润和分子表达都具有免疫治疗的潜力。白细胞分数和TIS评分在C1中都比C2高，意味着对免疫治疗的反应性更强（图9D，E）。由于HLA分子的表达升高，推测C1的患者拥有更好的传递抗原的能力（图9F）。此外，Submap方法被用来识别对免疫疗法反应增强的人群，结果也表明，C1人群可能获得有利的临床效益（图9G）。总的来说，所有的证据都强调，C1具有增强的免疫复合物，可以发挥抗肿瘤的力量，可能更适用于免疫治疗。
图9 异质性坏死亚型的免疫景观
图S4 共刺激分子和共抑制分子的表达
随后，四个免疫治疗数据集包括41个应答者和98个非应答者，用于估计免疫治疗对C1人群的适用潜力。根据C1的特征基因，用ssGSEA方法为每个病人计算得分，并按中值将所有病人分为高组和低组。在GSE100797、GSE35640、GSE91061和Nathnaon数据集中，高组的患者对免疫疗法表现出更强的敏感性（图10A）。GSE100797、GSE35640、GSE91061和Nathanon数据集的曲线下面积（AUC）值进一步检验了免疫疗法评估的准确性（图10B）。综合来看，C1的患者更适合免疫治疗。
图10 免疫疗法和药物相关治疗的评估
05 - 为肝细胞癌患者开发潜在的治疗药物
为了给每个病人量身定做个性化的临床治疗，作者采用了脊回归模型和CMap数据库来识别潜在的治疗药物。一种策略是使用基于pRRophetic软件包的脊回归模型；通过半最大抑制浓度（IC50）计算和量化药物敏感性数据，开发候选药物。C1的患者可能对索拉非尼、obatoclax、拉帕替尼和顺铂怀有较好的反应，因为IC50值较低（图10C）。此外，C2的患者对ABT.263、ATRA、BIBW2992、JNK.Inhibitor.VIII和PF.4708671显示出更大的敏感性（图11A-E）。所有这些候选药物可能为特定的HCC患者带来有希望的理想疗效。另一种方法是结合CMap数据库；在分子亚型和疾病表型之间寻求相反的表达模式，以确定潜在的化合物并阐明其作用方式（MoA）。共有22种药物对坏死性亚型具有个性化的治疗潜力（图11F）。此外，还描述了这些候选药物的途径，可以利用这些途径来开发更多的治疗药物（图11G）。不同的药物和靶向途径可能指导个体化治疗模式，以提高临床效益。
图11 有前景的治疗药物
四、结论
这项研究揭示了肿瘤的异质性，并提供了两种HCC的坏死亚型。异质性的分子特征在坏死性亚型中得到进一步揭示，它们具有不同的临床结果、基因组图谱、生物行为和免疫特征。C1型患者更容易从免疫治疗中获得明显的疗效。对于C2患者，本研究开发了对患者有理想疗效的潜在治疗药物，改善他们的预后。总的来说，这项工作对基于坏死的肿瘤异质性有了新的认识，并为HCC患者定制了个性化的治疗策略。
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