今天跟大家分享的是一篇非肿瘤疾病分析文章，该工作对33个胎盘样本根据其临床数据分成三类：早发型重度子痫前期、晚发型重度子痫前期和晚发型中度子痫前期，对三种临床类型样本与32个正常样本比较，识别差异表达基因，并分析差异基因富集的通路。然后对子痫前期中涉及的转运蛋白基因构建了网络，并分析调控机制。最后识别了一些可能在早发和晚发患者中驱动大量基因失调的关键转录因子。Theranostics（IF：8.579）Distinct placental molecular processes associated with early-onset and late-onset preeclampsia
不同的胎盘分子过程与早发和晚发子痫前期相关
子痫前期（preeclampsia，PE）指妊娠20周以后，孕妇出现血压升高和蛋白尿，并头痛、眼花、恶心、呕吐、上腹不适等症状。子痫是由子痫前期发展成更为严重的症状，会引起抽搐发作或昏迷。PE会导致严重的母儿并发症。除终止妊娠外，无有效治疗方法。胎盘被认为是导致PE的根本原因。早发型PE患者比晚发型PE患者有更严重的孕产妇并发症和围产期并发症。
一、摘要
子痫前期患者表现出一系列的发病时间和严重的临床表现，但早发和晚发型临床亚型的潜在分子基础尚不清楚。虽然相关研究已经对PE患者的胎盘进行了几项转录组分析，但由于样本量非常小，且无法区分临床亚型，只确定了少量的差异表达基因。该工作对65份（33个来源于患者，32个来源于控制组）高质量的胎盘样本进行了RNA-seq，识别了失调基因及其参与的分子网络和通路。该工作还发现了一些可能在早发和晚发患者中驱动大量基因失调的关键转录因子。这些结果说明早发型和晚发型重度子痫前期有不同的分子机制，而晚发型轻度子痫前期可能没有胎盘特异性的病因。少数调节因子可能是失调分子通路的关键驱动因素。
二、数据及方法
1. 胎盘样本测序数据
从中国南方医院妇产科获取30例正常人的32个胎盘（其中4个来自2对双胞胎）和30例PE患者的33个胎盘（其中6个来自3对双胞胎）样本，以及每个患者的临床特征数据。将患者分成三个临床亚型：（1）早发型重度子痫前期（EOSPE）；（2）晚发型重度子痫前期（LOSPE）；（3）晚发型中度子痫前期（LOMPE）。该工作对65份胎盘样本进行了RNA-seq。
2.其他数据
（1）从6篇meta-analysis文章、1篇文献策展和1篇RNA-seq研究性文章中收集了1177个PE关联的基因。
（2）从经典精神分裂症数据库和文献中收集了3437个精神分裂症相关基因。
（3）在Gene Ontology（GO）数据库通过检索关键字“transporter”、“carrier”或“substrate exchanging”，收集了1554个转运蛋白基因。
3. 去除血液污染
被污染的脐带血细胞不能完全从胎盘组织样本中洗掉，因此提取的RNA中包含一些来自脐带血细胞的RNA。使用脐血标记基因表达水平进行标准化去除污染。采用相同的RNA-seq方法对两名正常孕妇的脐带血样本进行测序。将两份脐带血样本与两份正常胎盘样本进行差异表达基因分析，确定标志基因。使用血红蛋白亚基Mu（HBM），这是血红蛋白的一个亚基，在红细胞中特异性表达，并根据以下公式重新校准原始基因计数。
4. PE样本的聚类分析
对PE样本（包括EOSPE、LOSPE和LOMPE样本）进行聚类分析。使用所有PE样本的前500个最大方差（基因）聚类，最后聚成两类。然后对两组患者的临床特征进行了比较。
5. 识别差异表达基因（DEGs）
利用heat-map根据基因（在所有样本的raw count大于1）表达计算每组样本的相似性，并使用变异最大的前500个基因进行主成分分析（PCA）。使用R包DESeq2和edgeR对PE临床亚型进行了四种比较：（1）所有PE胎盘样本（n = 33）与所有正常胎盘样本（n = 32）；（2）LOMPE胎盘样本（n = 9）与所有正常胎盘样本比较；（3）EOSPE胎盘样本（n = 9）与所有正常胎盘样本比较；（4）LOSPE胎盘样本（n = 15）与所有正常胎盘样本比较。DESeq2中adjusted P≤0.05以及DESeq2中FDR≤0.05认为差异表达。这两种方法识别的差异表达基因交集为每次比较的最终结果。由于在LOMPE与正常样本比较时识别极少数的差异表达基因，所以将DESeq2和edgeR的结果并集作为最终的结果。
6. 通路富集分析
使用R包clusterProfiler进行KEGG通路富集分析。q≤0.2认为是显著富集的通路。用相同的方法对EOSPE和LOPSE中上调和下调的DEGs进行通路富集分析。使用clusterProfiler包对差异基因进行Gene Ontology富集分析，q≤0.05和 adjusted P≤0.05认为显著富集。使用基于语义相似度的方法（REVIGO）来获取富集的GO terms。
7. 网络聚类分析
使用Cytoscape的yfiles organic layout构建EOSPE和LOSPE差异表达转运蛋白基因的GO-term-to-gene-bipartite网络。然后利用GO条目中共享基因的数量计算Jaccard得分，并基于共享基因将GO条目聚类。结合网络布局和聚类分析结果，分别人工确定了5组EOSPE和2组LOSPE的GO BP条目。
二、结果
1. 基于临床特征的亚型分类和基于RNA-seq数据的样本聚类
获取胎盘样本并根据临床特点将其分类（图1A）。疾病组与正常组在收缩压等方面有显著差异，EOSPE与LOSPE在大多数特征上有显著差异。t检验显示，与正常对照组相比，LOSPE患者的C反应蛋白（CRP）水平显著升高，而EOPSE或LOMPE患者的CRP水平在正常范围内。
接下来通过PCA和样本聚类分析，分析样本基因表达水平的特征。发现EOSPE样本与4个LOSPE样本聚在一起，其余 LOSPE和全部LOMPE样本和正常样本聚在一起。这四个与EOSPE聚类在一起的LOSPE样本显示的临床特征与EOSPE类似，说明这四个“LOSPE”病人可能实际上是EOSPE病人，诊断时间晚于实际发病时间。然后提取了第一个主成分PC1的前50个基因，发现其中36个是已知的PE相关基因，说明这些基因可能是该病的潜在的分子标志。
图1. 临床亚型和基于RNA-seq数据的样本聚类
2. PE亚型中明显的失调基因
接下来使用两种不同的方法DESeq2和edgeR进行4组比较，识别差异表达基因（图2 B）。共发现3100个差异表达基因（DEGs），包括31个microRNAs和399个lncRNAs。识别了2977个EOSPE与正常的差异基因。而将所有PE样本与正常样本对照，只获得了1291个DEGs，说明EOSPE病例的遗传同质性可能提高了检测能力。识别了375个LOSPE与正常的差异基因，42个LOMPE与正常的差异基因（图2A）。三个临床亚型（EOSPE、LOSPE和LOMPE）中DEGs的数量差异很大，明临床亚型背后存在不同的分子机制。然后对部分差异表达基因进行了qPCR验证（图2C）。
接下来将识别的DEGs与文献中收集的1177个PE相关基因进行了比较。大部分文献中出现两次或两次以上的可信PE相关基因在我们的数据集中出现（图2D）。这些PE相关基因在EOSPE和LOSPE的DEGs中显著富集：在所有DEGs中富集19.3%，在EOSPE DEGs中富集19.5%，在LOSPE DEGs中富集26.7%，在LOMPE DEGs中富集7.7%（图2E）。
图2. 子痫前期胎盘的差异表达基因
3. PE涉及的分子通路
在EOSPE和LOSPE中识别的DEGs的差异数目很大，接下来对EOSPE蛋白编码DEGs（2298）和LOSPE蛋白编码DEGs（322）进行了KEGG和GO富集分析（图3）。发现EOSPE差异基因主要富集在代谢相关通路（图3A），且这些通路在以往的研究中发现许多与PE相关。LOSPE差异基因主要富集在免疫或自身免疫通路（图3A）。结果说明，EOSPE亚型可能主要是由于代谢紊乱引起的，而LOSPE亚型可能是由于胎盘免疫系统功能障碍引起的。
接下来GO分子功能条目富集分析（图3B），发现EOSPE差异基因在核糖体结构组成部分的关键分子活性等16个分子功能上显著富集，EOSPE差异基因在5个（其中3个涉及免疫应答）分子功能上显著富集。GO富集结果支持了上述结论。
图3. 差异表达蛋白编码基因富集分析
4. PE涉及的转运蛋白基因
在EOSPE的DEGs中发现了13.2%的转运蛋白基因，而在LOSPE的DEGs中发现的转运蛋白基因只有1.5%（图4A-B）。EOSPE的DEGs中205个转运体基因在397个GO生物过程（BP）中富集，对于这些基因，构建了一个包含5组功能相关基因的GO-term-to-gene bipartite网络（图4C）。组1含有参与不同离子通道的基因，其中一些先前被报道与PE有关；组2包含参与大自噬的基因，先前也被认为参与PE；组3是参与己糖的跨膜运输等的基因；组4是参与跨膜运输等的基因；组5是激素转运基因等。LOSPE差异基因中的23个转运蛋白基因在93个GO生物过程中富集。为这93个术语构建了GO term-to-gene-bipartite网络，其中包含2组功能相关的基因（图4C）。A组包含15个涉及离子通道的基因，B组只有8个涉及氯离子、羧酸、cAMP和阴离子运输的基因。
胎盘作为母体和胎儿循环之间的分子屏障，跨膜转运蛋白在胎盘交换功能中发挥关键作用。膜转运体的数量、密度和活性的失调会影响营养供应，进而影响胎儿的发育。观察到90% EOSPE患者的婴儿和53% LOSPE患者的婴儿低出生体重和胎儿生长受限，EOSPE组婴儿体重明显低于LOSPE组。
图4. 差异表达转运蛋白基因的功能分类
5. PE中关键的调控因子
接下来分析EOSPE和LOSPE中不同的基因表达模式关联的一组转录因子（TFs）。首先利用HOMER预测了EOSPE和LOSPE两组DEGs的TF结合motifs，在两组DEGs中识别富集motif。在EOSPE的2359（78.90%）个DEGs中，发现了23个motif；在LOSPE的301（80.27%）个DEGs中，发现了9个motif（图5A）。通过人工校验具有丰富motif的人类基因，构建了EOSPE和LOSPE的TF-靶点网络。BCL6等转录因子靶向上调的EOSPE DEGs，CUX1等转录因子靶向下调的EOSPE DEGs，而其他14种转录因子同时靶向上调和下调的DEGs（图5B）。这些TFs中一些与子痫前期有关，结果显示，少量的TFs可能调控PE中的许多功能基因。
然后进一步分析每个TF的靶点差异基因富集的生物学过程（图5C），对每个TF构建了“TF-Target-Pathway二分网络”（图5D-E）。BCL6调控PE的三个关键通路的差异表达基因靶点（图5D）。HIF1A调控PE的两个关键通路（图5E）。结果表明，少量的关键转录因子可能在很大程度上决定了EOSPE和LOSPE胎盘通路的失调。
图5. 识别导致EOSPE相关通路失调的关键转录因子
总结：
本工作首先对胎盘样本根据其临床数据分成三类：早发型重度子痫子前期、晚发型重度子痫前期和晚发型中度子痫前期。然后对样本进行聚类以分析不同临床类型之间的关系。然后对三种临床类型样本与正常样本比较，识别差异表达基因，并分析差异基因富集的通路：2977个基因在早发型重度子痫前期中差异表达，主要富集代谢相关通路；375个晚发型重度子痫前期差异表达基因，主要富集在免疫相关通路。接下来对PE中涉及的转运蛋白基因构建了GO-term-to-gene bipartite网络，并分析调控机制。最后识别了一些可能在早发和晚发患者中驱动大量基因失调的关键转录因子。
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