fastq数据格式

第一行：描述信息（包括表头、芯片 ID、第几个通道、识别碱基）
第二行：读取碱基
第三行：+
第四行：碱基质量分数，每个字符对应第二行相应位置碱基或氨基酸的质量，该字符可以按一定规则转换为碱基质量得分，碱基质量得分可以反映该碱基的错误率。(phred 33)

FASTQ Format (Illumina example)

质控和过滤

我们拿到公司的测序原始数据之后首先做数据的质控过滤（有些公司会提供已经做完质控和过滤的数据），常用的软件包括fastp、fastqc。

fastqc

采用FastQC（[http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc]）对数据进行质量控制。得到网页版的质量报告，再使用trim_galore去除质量低的和接头序列，trim_galore可以指定接头序列也可以自主查询，还可以通过--length设定长度的阈值，小于该阈值的序列会被扔掉。

fastqc -t R1.fq.gz R2.fq.gz #双端测序，-t表示线程数
trim_galore -q 20  -o ./  --fastqc --paired -j 2 R1.fastq.gz R2.fastq.gz
#--paired表示双端测序，-q 20表示去除Phred分数低于20的序列，-o表示输出（这里指输出到当前目录下），-j表示线程数，--fastqc表示清洗之后再交给fastqc做质控

FastQC结果解读

fastqc结果报告

我们主要关注如下几点

单碱基质量分布图

横坐标是reads碱基位置（5’->3’），纵坐标是所有reads在该位点碱基Q值统计。红线代表中位数，蓝线代表平均数，黄线代表25%-75%区间，触须是10%-90%区间。一般而言，reads的5’端和3’端的碱基质量较低，中间部分的碱基质量较高。从图中可知，本次测序过滤后的数据平均质量很高。

base content分布图

横坐标是reads中碱基位置（5’->3’），纵坐标是该位点某碱基所占的比例统计。对基于Illumina测序平台的基因组测序中，基因组片段化过程中前几个位置的核苷酸组成表现出一定的偏好性，而这种偏好性与测序的物种和实验室环境无关，但会影响基因组测序的均一化程度。除此之外，其余位置四种碱基的出现频率应该是接近的。因此，好的建库和测序样品的四条线应该平行且接近，当部分位置的碱基出现Bias时，则四条线在某些位置纷乱交织，往往提示有overrepresented sequence的污染，当所有位置的碱基比例一致地表现出Bias时，即四条线平行但分开，往往代表文库有Bias（建库过程或本身特点、或者是测序中的系统误差）。

GC content分布图
横坐标是GC比，纵坐标为对应的 reads 数量。红色表示的是实际分布曲线，蓝色的是理论分布曲线（峰值与物种特性有关）。
Sequence base quality分布图

Sequence base quality 主要用来检测测序数据的平均质量分布情况。峰尖代表测序质量，峰宽表示测序整体质量分布，较大峰宽或者前拖尾峰表示测序数据的部分数据质量偏低，峰尖对应的值较低表明整体测序结果较差。本次测序的峰值在Q36左右，表示测序质量较高。

fastp

测序数据包含一些带接头、低质量的 reads，这些序列会对后续的信息分析造成很大的干扰，为了保证后续信息分析质量，需要对下机数据进行进一步过滤，即将原始下机数据（rawdata）过滤生成高质量序列（high quality data）。使用 fastp (v0.20.0) 采用滑动窗口法对原始数据进行过滤，标准主要包括以下几点：
(1) 接头污染去除，去除 3' 端的接头污染；
(2) 质量过滤，采用滑动窗口法进行质量过滤，窗口大小设置为 5 bp，步长设置为 1 bp。每一次往前移动一个碱基，取 5 个碱基计算窗口的平均 Q 值，若最后一个碱基的 Q 值 ≤ 2，则仅保留该位置之前的碱基；若窗口的平均 Q 值 ≤ 20，则仅保留该窗口倒数第二个碱基及之前的碱基；
(3) 长度过滤,若双末端中任意一条 reads 的长度 ≤ 50 bp，则去除该双末端 reads。

fastp -l 50 -5 -W 5 -M 20 -i R1.fastq.gz -I R2.fastq.gz -o R1.clean.fastq.gz -O R2.clean.fastq.gz -j R1.json -h R1.html -w 2 &

fastp报告文件

做完数据清洗之后就可以进行后续分析了