基因的可变剪切造就了转录本的多样性，作为一种常见的基因表达调控机制，对于生物体的生长、发育和适应环境等方面都具有重要作用。前面写过一篇关于bulk RNA-seq的推文，谈过一点对可变剪切的感受，感兴趣的可以戳这里：bulk RNA-seq还有必要做差异可变剪切分析么？。
既然，可变剪切这么重要，在单细胞领域当然也是不可或缺的，所以针对单细胞也出现了不少的分析方法，这其中大部分方法的原理类似于bulk RNA-seq。但是，单细胞数据由于其测序方法的特殊性，为保证分析的质量，在做可变剪切的时候就不得不考虑这些因素，其中最重要的两个因素为数据的稀疏性、测序的不完整性(10x 3' gene expression)。
单细胞数据的稀疏性是不可以回避的因素。针对这个问题，有的软件直接采用合并数据的方法，先将数据分成不同的细胞亚群，然后将亚群内的细胞数据合并视为bulk RNA-seq数据，这样便可以轻松解决稀疏性的问题。相同类型的细胞有着相似的基因表达，而基因的不同转录本也正是可变剪接的结果，由此也有理由认为相同细胞类型具有相似的可变剪切。所以，虽然合并数据的方式牺牲了数据的分辨率，但也不失为一种增加数据丰度的有效方法。
单细胞测序数据的不完整性，例如10x 3'的捕获方式获取到的数据仅仅是转录本3'端的一小部分片段，这个问题是没办法像稀疏性那样通过数据本身来解决。对于这样的数据，也有软件还是采用类似bulk RNA-seq方式来做可变剪切，虽然不能说不对，但至少有失偏颇。
既然，单细胞数据分析的障碍更多的是来自于技术的限制，分析方法建立在数据之上，如果数据本身不完整，也只能死马当活马医，再好的方法也是治标不治本，形容的更离谱一点就是：巧妇也难为无米之炊。所以，想要更好更系统的解决这些限制，只能期待未来技术的发展推动分析方法的迭代。好在当下米虽然不多但至少还有一点，所以，需要做的事就是寻找到适合现有食材的烹饪方法，从而利用现有的数据挖掘出有用的信息。
SpliZ
目前，已有不少单细胞数据可变剪切相关的分析软件，其中一款软件的原理视角可谓是别出心裁，不管是从另辟蹊径的切入角度还是从文章中不错的效果来讲，都给人一种有点意思的读后感。利用一个Splicing Z-score作为基因可变剪切的整体分数，站在细胞群体的角度衡量剪切跨度的大小，从而评估不同细胞类型之间剪切发生的差异性。
上面的原理图看着不复杂，理解起来还是有点不够顺畅，下面还原一下示意图的计算过程：
- 计算剪切类型的均值和标准差
sj1rank <- (1+1)
sj2rank <- (2+2+1)
sj3rank <- (3+2)
sjmean <- (sj1rank + sj2rank + sj3rank)/12
sjsum <- (1-sjmean)^2 + (1-sjmean)^2 + (2-sjmean)^2 + (2-sjmean)^2 + (1-sjmean)^2 + (3-sjmean)^2 + (2-sjmean)^2
sjσ <- sqrt(sjsum/12)
sjσ
[1] 0.7637626
- 计算每种剪切类型的残差
sj1rs <- (1-2)/0.7
sj1rs
[1] -1.428571
sj2rs <- (2-2)/0.7
sj2rs
[1] 0
sj3rs <- (3-2)/0.7
sj3rs
[1] 1.428571
- 计算细胞内每个基因的剪切Z-score
cell1_gzs <- (-1.4*3 + 0*1)/4
cell1_gzs
[1] -1.05
cell2_gzs <- (-1.4*1 + 0*2 + 1.4*1)/4
cell2_gzs
[1] 0
cell3_gzs <- ( 0*1 + 1.4*3)/4
cell3_gzs
[1] 1.05
经过排序和计算，细胞中每个基因都被赋予了一个整体剪切的评估分数，分数值的大小直接与剪切的跨度大小直接关联，值越小跨度越小，值越大跨度阅读。当然，具体的计算过程比这里展示的要复杂的多，比如剪切跨度考虑方式为3'和5'两种情况等。通过该分数值便可以分析不同细胞类型之间的可变剪切差异。
流程分析结束会得到一个表格，记录了每个细胞中每个基因的SpliZ分数，即下面结果的中scZ：
SpliZVD
文章中还定义了另外一个值SpliZVD来衡量剪切的情况，即上面结果中的svd_z0 - svd_z2，分别对应特征矩阵前三个向量计算的分数值。从该分数的名字可以看出与SpliZ有些关系，这也可以从文章给出的流程图看出。
虽然有关联，但不要被迷惑。这里的SpliZVD肯定不是由前面介绍的SpliZ直接计算而来，因为前面的SpliZ在计算过程中已经丢失了剪切位点信息，而SpliZVD需要经过奇异值分解来达到数据降维的效果。所以，这里应该是采用类似SpliZ的计算过程，先是计算出每个基因所有剪切位点的评分值，也就是说上面的SpliZ分数是基因水平，而这里的是位点水平。然后，采用奇异值分解的方法得到基因水平的SpliZVD分数。相较于前面的SpliZ分数，SpliZVD不受read depth影响。并且，利用SpliZVD的计算也可以发现具有驱动作用的剪切位点。关于SpliZVD计算过程的理解本人也是一知半解，感兴趣的可以直接看原文献：<The SpliZ generalizes 'percent spliced in' to reveal regulated splicing at single-cell resolution>。
SpliZ和SpliZVD都是从基因水平的角度赋予剪切的整体打分，通过分数的大小可以判断不同细胞间剪切的区别，但这种视角仅是基因水平，也就是说仅仅知道细胞间某个基因剪切有差异，却不知道具体由于何种剪切导致。思路很新奇，分辨率却不足，没有像bulk RNA-seq可变剪切那样下沉到转录本水平。不过，SpliZ和SpliZVD并不受显现于测序类型，不管是部分转录本还是全长转录本的数据类型都可以应用。
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