大家好，今天要和大家分享的是2021年8月发表的一篇文章：“The molecular feature of macrophages in tumor immunemicroenvironment of glioma patients”。
神经胶质瘤是中枢神经系统中最常见的原发性肿瘤之一。在本项研究中，作者使用加权基因共表达网络分析（WGCNA）对具有意义的巨噬细胞相关基因进行聚类。利用Pamr、SVM和神经网络对聚类结果进行验证。体细胞突变和甲基化分析确定模块基因特征。分层组间差异表达基因（DEGs）经弹性回归和主成分分析构建MScores。最后基于单细胞测序分析巨噬细胞特异性基因在肿瘤微环境中的表达情况。研究结果表明，巨噬细胞与神经胶质瘤患者的生存呈负相关。通过弹性回归和PCA方法获得的26个巨噬细胞特异性DEGs在单核细胞水平上高表达。生存分析表明MScores预后模型的准确率较高，测序数据和免疫组化也证实了MScores的预后价值。
发表杂志：Comput Struct Biotechnol J.
影响因子：7.274
研究背景
神经胶质瘤是指起源于神经胶质细胞的肿瘤的统称，是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤，分为星形细胞瘤、少支胶质瘤、室管膜瘤、神经母细胞瘤肿瘤等。按照世界卫生组织（WHO）制定的分级系统将脑胶质瘤分为Ⅰ级（恶性程度最低、预后最好）到Ⅳ级（恶性程度最高、预后最差）。巨噬细胞是在先天免疫中对宿主防御内源性或外源性病原体至关重要的吞噬细胞。炎症刺激物是巨噬细胞活化的有效诱导剂。根据刺激物和细胞因子的类型，有研究提出巨噬细胞可以分化为经典激活的M1或替代激活的M2类型。M1巨噬细胞由脂多糖和干扰素γ等刺激物诱导，能够分泌促炎细胞因子。相比之下，M2巨噬细胞被白细胞介素4(IL-4)、IL-10、IL-13、集落刺激因子-1(CSF-1)和肿瘤生长因子-β(TGF-β)激活。它们与组织重塑、血管生成和过敏反应有关。肿瘤相关巨噬细胞（TAM）占神经胶质瘤微环境中非癌细胞总数的50%，并积极参与促进肿瘤进展和转移。
流程图
分析解读：
巨噬细胞相关基因模块的构建和验证
①通过xCell算法计算巨噬细胞、M1巨噬细胞、M2巨噬细胞的高、低中值水平，对患者进行分层。
①使用WGCNA对巨噬细胞相关基因并进行聚类，并研究模块基因与巨噬细胞相关基因显着性之间的相关性。
②对TCGA队列中相应基因表达谱的胶质瘤患者进行PAM处理。
③PCA区分样本和TCGA数据集。
③对两组进行生存分析。
④通过pamr在3个CGGA队列中验证聚类结果。
⑤SVM和神经网络进一步验证了聚类结果。
结果：
下图A：聚类树形图表明PAM确定的两个聚类模块明显分离。
下图B：TCGA数据集中PCA的样本聚类。
下图C：两组患者Kaplan-Meier生存分析。
下图D：pamr对聚类结果的验证。
下图E：选择最优阈值，减少误差。
下图F：13个基因分化能力的热图，红点和绿点代表按基因分类的样本。
下图G：神经网络聚类的验证。
下图H：SVM的聚类验证。
临床和肿瘤微环境分析
①在TCGA中研究2种亚型64种细胞类型水平的表达差异。
②在TCGA队列中检查了免疫浸润微环境的ESTIMATE评分、癌症生物学行为的指标以及免疫细胞水平之间的关联。
③比较两模块之间抗原提呈、细胞表面受体、共抑制、配体和细胞粘附相关的免疫检查点分子的水平。
结果：
下图A：TCGA中64种细胞类型和巨噬细胞水平的相关树状图。
下图B：TCGA中2个组的ESTIMATE Scores、Imune Scores和Stromal Scores。
下图C：TCGA中免疫检查点通路的分子水平。
基因组特征分析
①利用TCGA数据集进行体细胞突变和拷贝数变异(CNV)分析以探索这两组基因的基因组特征。
②分析不同类型的体细胞突变，包括单核苷酸变异(SNV)、单核苷酸多态性(SNP)、插入、缺失和IGR。
结果：
下图A：两组的总体CNV分布图。
下图B：两组中gain或loss突变的分布。
下图C：组1和组2中最常改变的基因列表。
甲基化分析
①根据每个遗传特征/染色体对差异甲基化位置(DMP)进行分层，并识别差异甲基化探针和区域。
②评估探针信号与基因表达水平之间的相关性。
③对DEGs和DMP相关基因进行GO分析和GSEA富集分析。
结果：
下图A：通过DMP聚类树状图显示出两组在临床和遗传性状上的良好分离。
下图B：DMP的火山图及其在基因中的位置。
下图C：全基因组DNA差异甲基化的Manhattan图。
下图D：两组的GSEA分析结果。
下图E：GO功能富集分析结果。
下图F：比较两组中几种免疫细胞类型的富集分数。
MScore的生成及功能注释
①通过弹性网络回归分析和PCA算法从434个基因中衍生出26个巨噬细胞相关基因并得到它们的系数。
②评估64种细胞类型的表达水平与MScores的相关性。
③分析验证MScores的预后价值。
④MScores在不同癌症类型中的富集分析。
⑤实验（免疫组化）验证结果。
结果：
下图A：MScores和64种细胞类型关联的树状图。
下图B：MScore不同免疫调节过程的GO功能富集分析。
下图C：TCGA的泛神经胶质瘤、LGG和GBM组中MScores的生存分析。
下图D：基于单变量Cox回归分析的MScores在不同癌症类型中的HR。
下图E：不同癌症类型中MScores的GO功能富集分析。
下图F：MScore在胶质瘤队列中的生存分析。
下图G：对25例LGG和15例GBM标本进行CD163染色。CD163分子免疫组化显示两组MScore中M2巨噬细胞密度不同。
下图：MScores在大多数神经胶质瘤队列中的生存分析。
MScore在免疫治疗反应中的预测价值
①基于MScores构建预后列线图。
②探索MScore的潜在免疫原性和致癌特征。
③评估MScores是否能够预测免疫阻断疗法对胶质瘤患者的治疗效果。
结果：
下图A：IMvigor210队列中高和低MScore组的Kaplan-Meier曲线。
下图B：rain-cloud图显示CR、PR、PD和SD组的MScores。
下图C：显示高低MScores比例的条形图。
下图D：柱状图显示了高、低MScore组中CR/PR和SD/PD患者的比例。
下图E：高和低MScore组中4种治疗反应类型的构成。
下图F：比较两个MScore组中CD274的水平。
下图G：黑色素瘤队列中MScores的生存分析。
下图H：不同应答组中高和低MScore的比例。
下图I：高、低MScore组中不同应答组的比例。
下图J：M2巨噬细胞的生理功能。
小结：
这项研究使用WGCNA对具有意义的巨噬细胞相关基因进行聚类，利用pamr、神经网络和SVM验证巨噬细胞聚类的结果。同时，为了验证巨噬细胞的预后价值，作者还评估了巨噬细胞分层胶质瘤患者的在泛癌基因组、肿瘤微环境、甲基化和体细胞突变的综合情况。随后，作者利用弹性回归和PCA生成基于巨噬细胞相关模块之间DEG的风险评分，并确定了一个由26个巨噬细胞特异性基因组成的巨噬细胞基因模型，并确定了它们在胶质瘤中的预后价值。
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