ChIP-seq实验一般会设置input作为阴性对照作为背景，这样在做peakcalling时可以去除噪音得到更真实的IP结合位点。如果使用macs2来做callpeak时，可以生成_treat_pileup.bdg、_control_lambda.bdg两个bedgraph格式的文件，里面分别存储了伪IP和Input的信号，为了方便在IGV里做可视化比较，一般会把bedgraph转换成bigwig的格式。为什么说是伪信号呢？关于这个问题的答案在之前的帖子里面做过比较，想知道的可以看戳这里[macs2 | model vs nomdel]。
为了检查IP实验的富集效果，一般会做一个IP和Input在基因周围的信号分布图，如转录因子和一些组蛋白会在基因上游的启动子区域结合，此时就会看到IP相较于Input会有一个很高的信号富集。但是，如果IP效果不好，就会出现一些奇怪的现象，如下图：
上面中的Input信号高于IP，这个现象就有点奇怪，为什么会这样呢？简单思考一下就会知道，即使IP没有富集效果也就相当于另一个Input，信号应该跟Input本身差不多，为什么会出现Input高于IP呢？因为上图是用_treat_pileup.bdg、_control_lambda.bdg两个文件的信号做出来的分布。如果了解macs2 callpeak的工作原理就不难理解，因为这不是真实的信号而是伪信号，尤其是Input的结果。
下面一段话来自软件的github，简要描述了callpeak时参数的选取和统计上是否富集的过程。
For each peak region, MACS calculates the a local lambda for poisson distribution based on the control tags within the 1kb, 5kb and 10kb (1/5/10k are parameters that you can modify) nearby regions to consider the local fluctuations and biases. The local lambda is the maximum of the averages of tags for 1/5/10 kb regions and a whole genome background. Then this local lambda is used to calculate the p-value of poisson distribution. If there is no control data, the ChIP data will be used instead, where the 1kb region is not considered. The fold-enrichment is also calculated using local lambda.
然后，再看看macs2软件对生成bedgraph文件的描述，由此可知，_control_lambda.bdg文件里面存储的是local lambda值，也就是期望值，并不是真实的reads信号。
-B, --bdg Whether or not to save extended fragment pileup, and
local lambda tracks (two files) at every bp into a
bedGraph file.
所以，当IP效果不好时，用macs2生成的信号文件来展示，便会出现违背印象的结果。当然，即使IP效果差只要结果有peak，那咱们可以看peak区域周边的信号分布，此时IP信号就会明显富集了，毕竟不富集也不会形成一个peak。
那真实信号分布又是什么样的呢？最真实的信号莫过于bam里面比对上的reads，为方便起见可用deeptools先转换为bigwig，然后再来看信号分布，如下图就显得比较符合预期了。
这大冬天的写个帖子真不容易，啥时候能去莫吉托喝一杯马尔代夫。。。
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