图1

1.Mutation load

肿瘤突变负荷

2.新抗原负荷（Neoantigen load）

        配对样本的全外的.bam数据，第一步通过POLYSOLVER tool工具对每个样本4-digit HLA基因型进行推断。体细胞突变数据（.maf）和HLA基因型数据作为输入文件，用NetMHCpan（v4.0）预测新的抗原。抗原通过蛋白编码单个核苷酸变异(SNV) (Variant_Classification = “Missense_Mutation”, and Variant_Type = ‘‘SNP”)，小的插入和缺失（Indel）(Variant_Classification = “Frame_Shift_Ins’’, ‘‘Frame_Shift_Del’’, ‘‘In_Frame_Ins’’, ‘‘In_Frame_Del’’, and Variant_Type = ‘‘INS”, “DEL”) 分别进行了预测。预测产生亲和力小于500nM的肽，且对应的基因表达超过Combat value 1（根据中值表达而不是特定样本进行评估）的突变被选为新的抗原。我们参考pVAC seq（10）并根据我们的数据集的特点对算法进行了修改。

图2

2.1 Polysolver tool

来源于：https://zhuanlan.zhihu.com/p/62944810（Polysolver预测HLA分型原理和测试）

原文链接：Comprehensive analysis of cancer-associated somatic mutations in class I HLA genes

        位于6号染色体上的HLA位点是人类基因组中最具多态性的区域之一，每个基因都有成千上万的等位基因。HLA基因体细胞突变率增高的发现，HLA功能障碍可能是某些癌症发生发展过程中免疫逃避的一种机制。每个个体表达6个主要组织相容性复合体(MHC) I类等位基因，由位于6号染色体两个同源拷贝上的3个基因(HLA-A、HLA-B和HLA-C)编码。

        使用WES数据对HLA分型的难点：1人类参考基因组的每个HLA基因都有一个单一的序列，很可能会歪曲个体的真实等位基因，从而导致次优比对。2.HLA基因富含GC碱基，因此由于捕获和扩增效率低，测序覆盖率低，测序错误增加，从而进一步降低了比对率。针对这些原因作者开发了Polysolver算法，使用相对低覆盖率的WES数据，也可以实现高精度的HLA分型。

    具体操作：下载镜像，分型，变异检测，注释突变看链接内容吧~大自然的搬运工工作量有点大~

2.2 NetMHCpan（v4.0）

        来源于：https://cloud.tencent.com/developer/article/1556616

        NetMHCpan软件用于预测肽段和MHC I型分子的亲和性，基于人工神经网络算法，以180000多个定量结合数据和MS衍生的MHC洗脱配体的组合为训练集构建模型，结合亲和力数据来自人，小数，猪等多个物种的MHC分子，MS洗脱的配体数据来自55个人和小鼠HLA等位基因。

        操作步骤：第一步上传涵盖了体细胞突变位点的氨基酸序列，上传的氨基酸序列是突变之后的序列，不是野生型的蛋白序列；第二部选择切割肽段的方式，抗原通过抗原表位与MHC分子结合，MHC I型分析可以结合的抗原表位长度为8-11个氨基酸，对应8-11mer，先将蛋白序列切分成短的肽段之后进行MHC分子亲和性的预测；第三步选择HLA allel，确定之后点击提交按钮即可。

3.同源重组缺陷评分（HRD）

HRD score计算了三种得分的和：等位基因不平衡延伸至端粒（NtAI）评分，杂合缺失（LOH）评分和改良大范围状态转换（LSTm）评分。NtAI score被定义为等位基因不平衡超过11MB并延伸到其中一个子端但不穿过丝粒区域数。LOH分是长度超过15MB但是小于全染色体的LOH区域数目。LST分是过滤掉小于3MB区域后，和大于10MB区域之间的断点数。为了减小倍性影响，LST评分采用LSTm=LST-Kp，p为倍数，k为15.5常数。

图3

4.CTA load

        CTD数据库访问CTAs。我们之后计算肿瘤样本和对照样本中每个CTA的差异；在至少一名患者中，肿瘤部位表达至少是配对正常组织的4倍的基因被选择作为TNBC-specific CTAs.本研究共包含177个CTAs。

图4

5.Necrosis

6.ITH

    ITH肿瘤内异质性，指随着癌细胞不断生长，其分类后的子代和父代之间会有很大的差异。整合拷贝数数据和体细胞突变数据用ASCAT分析，用默认参数估计每个肿瘤的纯度和倍性。然后使用改进的PyClone工作流来估计每个样本癌细胞分数，以亚克隆细胞百分率代表ITH。

图5

        Pyclone：可以分析相同病人不同部位，或者不同时间得到的取样，中有哪些亚克隆。安装和使用可以参考一下文章,较为详细的https://www.yuque.com/biotrainee/wes/hrxfi6；使用PyClone来推断肿瘤纯度及肿瘤内部亚克隆结构(http://www.bio-info-trainee.com/3964.html)；癌症中克隆种群结构统计推断分析软件PyClone安装小记(https://cloud.tencent.com/developer/article/1360255).