2019年发表在 Nature Reviews Genetics 上的大神级综述文章“RNA sequencing：the teenage years”想必很多小伙伴已经看过了，文中综述了 RNA-seq 十年以来的发展，并介绍了转录组测序的一些新手段和新潮流。其中，UMI 绝对定量转录组测序（UMI-mRNA seq）就得到了作者的特别关注和介绍。如果你还不了解 UMI-seq 与普通转录组的区别，以及在转录组测序研究中的应用，往下看：
什么是 UMI- mRNA seq？
UMI 是“Unique Molecular Identifier”的缩写，即为分子标记，类似于我们常说的“barcode”标签，其目的是随机性地利用不同的分子标签标记和区分不同的分子[2]。图1是一个 7 nt 长度的 UMI 示意图。
图1 典型的 UMI 标记方式示意图[2]
利用唯一的随机分子标签标记的 RNA 或 cDNA 分子，在 PCR、测序乃至后续分析过程中都携带着这个独特的 UMI 标签。通过计数 UMI 的个数，我们便可以对原始的 RNA 分子进行“绝对定量”[3]。
为什么要使用 UMI- mRNA seq？
传统 RNA-seq 定量分析是存在一定缺陷的，其主要来源是建库过程中的 PCR 扩增。
图2 RNA-seq 的一般建库、测序和定量分析简述
如图2所示，在大部分文库构建过程中都需要利用 PCR 对 cDNA 文库进行扩增，以增加测序深度。然而研究人员们发现 PCR 扩增时对不同片段的偏好性是不同的，这也导致了扩增后测序分析的系统误差。之前发表的两篇文献研究了 RNA-seq 建库过程中 PCR 对片段长度和 GC 碱基含量的偏好，发现 PCR 对短片段（图3A）和 GC 含量偏低的片段（图3B）都有一定偏好性，并且造成文库片段丰度失真，对定量结果产生影响[4][5]。
图3 PCR 扩增对文库片段偏好性的影响[4][5]
上述系统误差随着 PCR 轮数增多而被放大，因而在一些起始样本量小的测序中会显得更为突出，无法真实地反应不同样本中基因或转录本的表达水平。而由于UMI- mRNA seq 是通过计数 UMI 对初始分子进行绝对定量，因而可以轻松解决这个问题。
UMI- mRNA seq 有什么优势？
首先，文献中对比了 PCR 误差对于利用普通 mRNA-seq 基于 reads 计数和 UMI 基于标记分子计数的影响。结果发现对比15个 cycle 的 PCR 和25个 cycle 的 PCR 后的测序结果，UMI-seq 可以有效消除 PCR 带来的一定误差[3]。
图4 UMI 绝对定量转录组消除 PCR 误差[3]
其次，UMI- mRNA seq 有利于提高 RNA-seq 的可重复性。发表在 Genome Biology 上的文献就发现，在利用同类细胞进行的多组 RNA-seq 时，利用 UMI 计数的基因表达定量数相关性更强[6]。
图5 对比基于 read count 和 UMI count 的基因表达定量的重复性[6]
此外，UMI 标记的聚类和相关算法，还可以用以区分 PCR 扩增错误、测序错误和真正的突变，有助于发现稀有的突变[7]。
图6 利用 UMI 聚类进行突变和测序/测序错误区分[7]
目前 UMI- mRNA seq 已经被运用到最近发表的越来越多的高分文献中，可以说是转录组学研究的一个新潮流！这么优秀的工具，正在进行转录组学研究的你也值得拥有！
诺禾 UMI-seq
目前，诺禾致源有 UMI mRNA-seq 和 UMI Small RNA-seq 以满足大家的研究需要。
参考文献：
[1] R. Stark, M. Grzelak, and J. Hadfield, “RNA sequencing: the teenage years,” Nat. Rev. Genet., vol. 20, no. 11, pp. 631–656, 2019.
[2] S. Mangul, S. Van Driesche, L. S. Martin, K. C. Martin, and E. Eskin, “UMI-Reducer : Collapsing duplicate sequencing reads via Unique Molecular Identifiers,” bioRxiv, pp. 1–11, 2017.
[3] T. Kivioja et al., “Counting absolute numbers of molecules using unique molecular identifiers,” vol. 9, no. 1, pp. 3–7, 2012.
[4] J. Dabney and M. Meyer, “Length and GC-biases during sequencing library amplification: A comparison of various polymerase-buffer systems with ancient and modern DNA sequencing libraries,” Biotechniques, vol. 52, no. 2, 2012.
[5] D. Aird et al., “Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries,” 2011.
[6] W. Chen, Y. Li, J. Easton, D. Finkelstein, G. Wu, and X. Chen, “UMI-count modeling and differential expression analysis for single-cell RNA sequencing,” pp. 1–17, 2018.
[7] R. Kou, H. Lam, H. Duan, L. Ye, N. Jongkam, and W. Chen, “Benefits and Challenges with Applying Unique Molecular Identifiers in Next Generation Sequencing to Detect Low Frequency Mutations,” pp. 1–15, 2016.
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