转录组学习一（软件安装）
转录组学习二（数据下载）
转录组学习三（数据质控）
转录组学习四（参考基因组及gtf注释探究）
转录组学习五（reads的比对与samtools排序）
转录组学习六（reads计数与标准化）
转录组学习七（差异基因分析）
转录组学习八（功能富集分析）
任务
- 学习的文章是：《AKAP95 regulates splicing through scaffolding RNAs and RNA processing factors》. Nat Commun 2016 Nov 8;7:13347. PMID: 27824034
- 在文章里面找到数据地址GSE81916 这样就可以下载sra文件作业，看文章里的methods部分，把它用到的软件和参数摘抄下来，然后理解GEO/SRA数据库的数据存放形式。
<font color =orange>文章</font>
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主要内容的是利用RNA-seq及RIP-seq(RNA-immunoprecipitation)来证明AKAP95对转录后调控的 可变剪接具有重要作用。
其中对于RNA-seq分析部分主要在Methods方法的Bioinformatic analyses： - 测序平台：Illumina HiSeq 2500
- 取样物种：Homo sapiens和Mus musculus 的293个cells
- 数据类型： 双末端PE reads 2 x 50bp
- 参考基因组：人类参考基因组CRCh37/hg19
- 比对软件：TopHat(v2.0.13)
- GTF文件类型：GRCh38.70
- 比对数据质控：过滤低质量比对reads(MQ > 30)
- 平均插入长度及标准差(mean insert sizes and the s.d.'s)：Picard-tools(v 1.126)
- 计算reads count: HTSeq(v0.6.0)
- 差异基因分析：DESeq(v3.0)
- 差异外显子分析：DEXSeq(v3.1)
- (RPKM/FPKM?)The read per million normalized:BEDTools(v2.17.0), bedGraphToBigWig tool(v4)
- GO富集分析：DAVID
<font color =orange>数据</font>
- 首先简单介绍NCBI的GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)
GEO数据库(Gene expression Omnibus)就是当今最大、最全面的公共基因表达数据资源。简单说GEO就是一个公共数据库，包含大多数已在杂志发表文章的原始数据。
- 主页输入文章的登录号GSE81916。根据Overall design可知：1-8位RIP-seq数据，9-15为RNA-seq数据。其中9-11为AKAP95敲除后在人类293个cells里的数据，12-15为在小鼠ES cells里的数据。故我们需要下载9-15的RNA-seq数据。
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另外一个重要的数据库就是SRA Run Selector(https://trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/study/?go=home]r)。同样搜索数据登录号GSE81916。得出关于这些数据的基本信息，其中我们所关注的RNA-seq数据的基本信息如
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- SRR原始数据文件为SRR35899{56..62}
- 其中56~58为人类数据 56为对照组，57, 58为控制组
- 59~62为小鼠的数据.实验处理方式如图：
- 最后下载SRR35899{56..62}这7个数据集
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看了一下，这7个SRR数据需要10.38Gb 解压完全之后共占空间24.17Gb，数据量感觉"比较大"。
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<font color =orange>下载</font>
总共10Gb的数据量下载起来还是需要挺长时间的。目前所知道的有两种下载方式：sratoolkit里自带的preftch程序，与直接循环脚本wget下载数据。
- Sratoolkit下载
mkdir rna_seq_test && cd rna_seq_test
###根据SRR数据结尾可知变化的数值主要是最后两个56~62故
for i in `seq 56 62` ## shell的``与seq 两个用法
do
nohup preftch SRR35899${i} & ##preftch与 后台运行
done
preftch程序会将数据下载存储在$HOME/ncbi/public/sra/目录下。总共10.38Gb，慢慢下。
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直接根据ftp网址用wget下载
ftp网址一般都是具有规律的。根据徐洲更所提各种网址会分为共同部分和变动部分
FTP网址(ftp://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov/sra/sra-instant/reads/ByStudy/sra/SRP/SRP075/SRP075747)可以分为以下部分(可以自行删除探索其他网站部分)- 所有SRA数据的共同部分：ftp://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov/sra/sra-instant
- reads表示存放reads数据，在FTP可以看到另一个选项是analysis，表示分析结果的文件
- ByStudy表示根据Study进行分类，其他还可以根据实验ByExp,根据Run,ByRun.
- sra/SRP/SRP075/SRP075747: 进一步的分类检索。
可以知道这些文件的地址改变只有最后两个数字的不同。故循环脚本下载如下
for i in `seq 56 62`
do
nohup wget ftp://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov/sra/sra-instant/reads/ByStudy/sra/SRP/SRP075/SRP075747/SRR35899${i}/SRR35899{$i}.sra &
done
最后总共下载完10多G啊，截个图
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2017/10/14 Sat.晚8点小结：对知识点： GEO、SRA数据库， 简单的循环脚本 做了进一步的熟悉。仍然存在的问题就是这些SRA数据包括的数据具体是什么，是如何设计实验方案的。这些预计在接下来解压的文件和后续分析中会有所解释。
参考文章
- 徐洲更 （伪）从零开始学转录组：读文章拿到测序数据 https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzI1MjU5MjMzNA==&mid=2247484450&idx=1&sn=61784c91c745b0e3705bbc9145e69f3c&chksm=e9e02d83de97a495a87df0008977d2213736ab0505372c2f04a517ffcfcbf52747e911e89851&scene=21#wechat_redirect
- 青山屋主 如何从NCBI下载高通量数据 http://fbb84b26.wiz03.com/share/s/3XK4IC0cm4CL22pU-r1HPcQQ2FSGeS3LE4tM2rg0A-1qRcP-
- 沈梦圆 PANDA姐的转录组入门(2)：读文章拿到测序数据 https://mp.weixin.qq.com/s/kRSIHuXtgZs6HWiPwYnSmA
- GEO数据库简介 https://wenku.baidu.com/view/907abb0c1711cc7931b716e4.html
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