这次介绍的是整个双受精过程的简介，是最最原始的初稿，文字啰嗦，图不对文，我在我读研的这几年内想把整个受精过程参与的因子都尽可能完善，欢迎各位读者及时补充交流。
双受精主要是被子植物（当然裸子植物麻黄属和买麻藤属也存在）特有的生殖方式，其过程主要是成熟的花粉粒落在柱头上水合萌发形成花粉管，花粉管穿过引导组织，穿过隔膜，进入胚珠后花粉管爆炸释放出两个精细胞，其中一个精细胞与卵细胞结合，最后发育成胚（2n），另外一个与中央细胞融合发育形成胚乳（3n）。
The pollen tube journey from stigma to synergid
植物生殖过程中演化出了许多独特的生理机制，例如花粉管的顶端生长（tip growth），在植物生长发育和环境中过程中，有很多种顶端生长的例子，如真菌的菌丝，植物的根毛以及毛状体，目前花粉管的顶端生长是顶端生长生长最快的一种形式之一，所以以花粉管为模型研究顶端生长是一个很好的方式。目前花粉管生长区别于其他细胞生长有两个最重要的特点，一是花粉管于顶部向顶端生长，二是通过果胶甲基酯酶（PME，如VANGUARD1）对果胶的去酯化作用会使得顶端新形成的细胞壁沉积物之间产生空间上距离。这种去酯化作用产生的羧基使果胶与其他聚合物形成Ca2 +-盐桥，从而形成果胶凝胶，有助于使壁硬化。在顶端PME会与PMEI（PME的抑制物）相互作用形成复合物来抑制PME的酶活，随着顶端不断向前生长，复合物逐渐解散，使得细胞壁硬化。此外花粉管细胞壁还具备许多多糖以及不同的修饰形式，如乙酰化，硼酸二酯交联，岩藻糖基化木葡聚糖的分泌以及纤维素和胼胝质的局部合成。
其中分泌蛋白 LRXs（leucine-rich repeat extensins）可能参与了花粉管细胞壁和膜结构的修饰， LRX8, 9, 10, 11这四个蛋白mRNA在花粉中的表达量极其高。lrx 突变体显示花粉管处存在纤维素和胼胝质的不正常积累，且四突雄配子体的传递率下降了六倍。如果在lrx 突变体中添加Ca+能部分抑制突变体的表型，暗示着LRX可能通过Ca信号才调控下游过程。此外LRX8以及其他三个LRX可以和小肽RALF4/19（rapid alkalinization factor 4/19)相互作用来调控ANXUR1 (ANX1) 和ANX2使得花粉管的爆炸。其中有一个有趣的问题是，花粉细胞分泌多种水解酶，其可能降解花粉管或周围雌蕊细胞的细胞壁并产生DAMP(damage-associated molecular patterns)，那么植物是如何区别这两者从而保护正常的生殖过程的呢？
此外， ROPs（Rho GTPases from plants）以及其下游的效应因子作为主要调控者调控了细胞极性生长，同样参与花粉管顶端生长极性的建立。ROPs家族共有11个成员,其中ROP1主要调控了花粉管的的顶端生长，当ROPs结合GTP时，会变成激活构像，当GTP水解成为GDP时，会变成非激活的构像。GDP到GTP的转化是被GEF(guanine nucleotide exchange factor）催化。激活状态下的ROP–GTP能够与一系列的效应因子相互作用，但是仅仅只有一小部分被鉴定出来，因为ROP固有的GTP酶活性会将GTP转化成GDP，所以与ROP–GTP相互作用的效应因子是非常瞬时的，因此非常难以鉴定。其中ROP–GTP的激活构像持续时间会被GAPs(GTPase-accelerating proteins)缩短从而增加GTP的水解速率，同时ROP-GDP也会与GDIs(GDP-dissociation inhibitors)相互作用，从而使得GDP不会被GEFs催化形成新的GTP。GAPs, GEFs 和 GDIs其活性均可被磷酸化和去磷酸化调节，主要是受 CPKs(Ca2+-dependent protein kinases), MAPKs( mitogen-activated protein kinases)和 RLKs调控。在顶端生长的过程当中RIC4（ROP-interactive CRIB motif–containing protein 4）和RIC起到非常重要的作用，RIC4能够促进F-肌动蛋白的组装，而RIC3会刺激Ca2 +浓度瞬变，从而使得F-肌动蛋白的分解。但是目前还不清楚RIC3是否是直接与Ca+通道蛋白相互作用还是与激活了一条新的信号途径来调控Ca2+。此外，位于ROP-ATP下游的NOX（NADPH oxidase）也起到非常重要的作用，NOX可以产生ROS来调控细胞壁的修饰并且激活新的信号通路，目前认为ROS可以激活一条尚未鉴定出的Ca2+通道，有趣的是NOX还可以被Ca2+ 和 CPKs直接激活，这就可能推测这里存在一条正反馈的机制：ROS诱导的钙信号反过来调控新的ROS通路，或者可能是以ROS 到 Ca2+ 调控 ROS 再到 Ca2+引发的钙振荡来调控下游过程。在顶端汇集的细胞质钙震荡到底是标志着生长周期的开始还是结束呢？这是目前生殖领域比较关心的科学问题之一。但是目前研究发现这种钙振荡可能需要多个过程协调激活，例如通过离子通道蛋白的Ca2+离子内流或离子泵和离子交换蛋白引起的Ca2+外流，可是在模式植物拟南芥的花粉中至少有潜在的39个基因可以编码Ca2+通道蛋白，包括 CNGCs(cyclic nucleotide gated channels),GLRs(glutamate-like receptors), MSLs(mechanosensitive-like channels), OSCAs(reduced hyperosmolality-induced[Ca2+]i increase channels), 一个Piezo离子通道和膜联蛋白。目前关于CNGC18和GLRs的突变体的研究发现这些通道的缺失并不能使得顶端钙振荡消失，除了Ga2+本身运输可能会影响顶端Ca2+的聚集之外，还与细胞骨架动态变化相关。此外在拟南芥中至少存在230个花粉特异表达的基因可以与Ca2+结合或者是参与Ca2+的信号通路，例如CBLs(calmodulins or calcineurin B–like proteins ),CPKs和CBL-interacting protein kinases，因为CPKs可以磷酸化下游数百个蛋白，所以要理解Ca2+是如何影响顶端生长还是个复杂的问题。在先前的研究中，认为Ca2+的每一次震荡都对一次生长周期至关重要，但是钙成像实验显示，在一次钙振荡过程中，生长周期已经完成多轮，所以这些观察结果表明，Ca2+振荡不是生长周期所必需的，Ca2 +振荡可能作为开关间歇地起作用，以重新同步或重启细胞过程。
Ca2+ circuits of potential importance to regulating tip growth）
A ROP–effector signaling hub
第一阶段：花粉落在柱头上，标志着雌雄配子双方密切的信号交流开始
当花粉落在柱头上开始，复杂的信号交流便开始了，首先雌方需要确定花粉是不是合适的（杂种不育或是自交不亲和），如果合适才会经过粘附、水合、萌发的步骤形成花粉管。花粉在柱头上水合的过程是收雌雄双方的调控的，水合过程中会引起花粉粒内Ca2+的内流，随后还会引起花粉粒内细胞质的重塑和ROS的累积。目前对于各向同性的花粉粒产生极性生长的花粉管的机制还不是很清楚，可能是细胞质内钙离子浓度的梯度分布或是RIP1(ROP–interactive partner 1)的定位又或是Exocyst复合体中的SEC3A亚基作用于在花粉管出现的地方。此外，快速水合过程中水进入引起渗透压的改变为什么没有使得花粉粒裂解也是一个重要的问题，例如大肠杆菌能够通过使用机械敏感性通道释放渗透物来防止细胞裂解。花粉特异表达的MSL8（mechanosensitive-like channel 8）可能具有相似的功能，水通道蛋白的调控以及鞘脂也在其中发挥作用。
在干燥的柱头，花粉萌发的速度很快，30min即可，但是在体外却要大于3.5h，这其中花粉上的脂质对于萌发过程至关重要，从柱头释放出来来的十氢喹啉衍生物以及油菜素甾醇可以刺激花粉的萌发和花粉管的生长。在对烟草的研究中发现，自噬对于烟草花粉的正常萌发非常重要。在百合中存在chemocyanin碱性小蛋白，可以在花粉萌发后，指导花粉管导向性生长。除此之外，花粉管的出现还需要突破物理上的阻碍，这就需要有关水解酶的分泌和活跃的信号传导，其中AtOFT1(OFUCOSYLTRANSFERASE 1)和tod1(turgor regulation defect 1,神经酰胺酶)的突变体显示穿过柱头和花柱隔层的能力变弱。
第二阶段:花粉管在花柱，引导组织，隔膜的导向性生长
引导组织具有特化的细胞外基质，是多糖，糖蛋白和糖脂的复杂混合物，被认为可以用来支持花粉管的生长。在有些植物当中花柱，引导组织，隔膜会作为自交不亲和发生的地点，但是在拟南芥中主要是为了让花粉管正常导向完成双受精。
目前对于花粉管快速生长依据的原料还不清楚，在烟草中的TTS(TRANSMITTING TRACT–SPECIFIC)蛋白TTS1和TTS2可以在体外刺激花粉管生长，但是TTS在拟南芥的同源物是否能刺激花粉管的生长还未知。GABA 和GABA和d-serine两个氨基酸分子能够促进花粉管的生长。外源的GABA能在体外影响花粉管生长，在较低浓度下刺激花粉管生长，在较高浓度下抑制花粉管伸长，柱头产生的d-serine可能作为花粉管顶端GLRs的激动剂调控Ca2+来促进花粉管在花柱，引导组织和胚珠的生长。花粉管表达的GLR的功能取决于亚细胞定位，而亚细胞定位又由CNIH（CORNICHON HOMOLOG）分子伴侣调节。 但是，d-serine触发的Ca2+信号传导的特定功能仍有待确定。据目前的实验观察，花粉管粘附在引导组织上对于花粉管的正常生长至关重要，使用体外粘附生物测定法鉴定了百合花粉管粘附所必需的两个分子。两者中较大的是果胶而较小的分子是脂质转移蛋白SCA(stigma/stylar cysteine-rich adhesin)，两个分子都非常重要，单独之一并不能重复粘附过程。此外有意思的，如果花粉在体外萌发，最后找到珠孔的能力很弱，但是穿过花柱和引导组织后，找到珠孔的能力大大增加，并且转录组数据显示，穿过花柱和引导组织会使得原先数千个不表达的基因表达。在蓝猪耳中，一个胚珠起源的蛋白AMOR(ovular methyl-glucuronosyl arabinogalactan)，能够使得花粉管穿过体外切割过得花柱来响应胚珠产生的信号。AMOR被鉴定为阿拉伯半乳糖多糖，其末端的4-O-甲基-葡萄糖醛酸残基是主要的功能部位。
第三部分 珠孔导向
珠孔导向一般被认为是一个非常理想的模型来理解胞外的信号分子是如何引起胞内的信号转导途径。在先前的研究中发现助细胞对于珠孔导向非常重要，进一步深入研究发现位于助细胞上的丝状器上分泌的小肽信号参与了这个过程。第一个被鉴定出来参与珠孔导向过程的是玉米中的ZmEA1，利用RNAi的技术发现沉默掉ZmEA1后，花粉管不能找到珠孔，并且导致严重的育性下降。随后在蓝猪耳里鉴定到一组小肽LUREs能够吸引花粉管。随后在拟南芥中也找到了物种特异性的小肽AtLURE1也能参与花粉管的吸引（AtLURE1与LURE1在序列上无相似性，只是功能类似），AtLURE1是一组富含半胱氨酸的防御素样的小肽，在对AtLURE1.1–1.5的研究过程中，发现这组小肽特异性的定位在助细胞，蛋白从丝状器上分泌出来到珠柄。但是五突并没有产生败育的表型，随后通过建树又找到了两个与AtLURE1相关的基因并且展现出可以吸引花粉管的功能，并命名为AtLURE1.7，AtLURE1.8。有趣的是七突也没有明显的育性下降，暗示着AtLURE1介导的信号通路可能并不是对于植物生殖所必须的。那么他们的功能又是什么样的呢？通过将拟南芥的花粉与另一种与拟南芥亲缘关系很近的物种琴叶拟南芥的花粉一起共同授于拟南芥的柱头上，发现在AtLURE1信号正常的植物中，拟南芥的花粉管被优先吸引，竞争性明显；而在缺失了AtLURE1信号的atlure1突变体植株中，拟南芥的花粉管被优先吸引的能力就显著降低，这表明AtLURE1的生物学功能主要是促进近缘物种的生殖隔离，为达尔文提出的同种花粉优先的理论提供了分子水平的证明。此外，还有4个在myb98突变体中表达下调且无物种特异性的小肽XIUQIUs，在AtLURE1s七突的背景下敲除，发现存在20%的育性下降，并且XIUQIUs不仅可以吸引拟南芥的花粉管，还可以吸引其他近缘种如琴叶拟南芥和哈勒氏拟南芥的花粉管。
在整个珠孔导向的过程中，RLK也发挥着非常重要的功能。prk6（pollen receptor kinase 6）突变体在半体外的环境下不能响应AtLURE1.2的信号，PRK共有8个成员，其在番茄中的直系同源的基因已经知道可以通过自分泌和雌性表达的配体来调控花粉管的延伸。prk6prk3双突珠孔附近花粉管生长异常，prk6prk3prk1花粉管穿过柱头异常缓慢。此外，还有其他组发现了MDIS1–MIK组成的受体复合物，MDIS1, MIK1和MIK2的胞外域可以与AtLURE1.2互作，但是MDS1MIK1MIK2的突变体表现出细微的花粉管引导缺陷，但没有像在prk突变管中观察到的花粉管延伸的缺陷。那到底谁才是AtLURE1s的受体的呢？接着有报道通过生化和结构的方法，验证了AtLURE1s与PRK6的互作，但是了重复不出AtLURE1s与MDIS1–MIK的互作，因此很有可能AtLURE1s-PRK6小肽受体复合物介导了拟南芥进缘物种的生殖隔离。还有两个RLCK LIP1(LOST IN POLLEN TUBE GUIDANCE)和LIP2也被报道能够响应AtLURE1的信号。但是目前XIUQIUs的受体还没有发现。
PRK6可以与ROP–GEF相互作用，暗示着AtLURE1s-PRK6会激活了下游ROP和Ca2+，两个钾转运蛋白chx21和chx23也对珠孔导向的过程非常重要。此外，在珠孔的的过程中值得关注的是，通过情况下，胚珠仅仅吸引一根花粉管，但是如果受精失败，则会吸引第二根花粉管，暗示着植物里存在某种机制在受精成功后能够抑制花粉管再次进入受精成功的胚珠，可能与乙烯信号导致的助细胞退化相关。
guide pollen tubes into the micropyle
AtLURE1/PRK6-mediated signaling
第四部分 花粉管的接收
一旦进入胚珠，花粉管会缓慢通过丝状器最终在助细胞处停止生长爆炸，花粉管的接收是种间杂交的一个重要的合子前障碍，在种间杂交中花粉管不能停止生长并释放精细胞。
FER(FERONIA)一个雌方表达的CrRLK1L的成员，其突变体花粉管过度生长，不能正常产生种子。其中FER和LRE（(LORELEI，GPI-anchored membrane protein）的协同作用对于花粉管的接收非常重要，在未受精的胚珠当中，LRE可以起到分子伴侣的作用一起和FER从内质网运送至助细胞的丝状器上。定位到丝状器上后，FER和LRE便成为ROP信号复合体的成员，调控ROS的产生，这对于花粉管的接收非常重要，并且FER的胞外域可以与LRE互作，有趣的是，异位在花粉管表达的LRE能够互补雌方lre突变体花粉管接收缺陷的表型，暗示着LRE在花粉管到达助细胞后在信号传递中的关键作用，且不同于其作为分子伴侣在细胞内作用。当花粉管与助细胞相互存在信号交流后，助细胞内细胞质的Ca2+浓度的改变以及Ca2+的振荡是依赖于FER和LRE。近期发现EN14(GPI-anchored membrane protein)也定位于助细胞的丝状器上并且可以与FER相互作用。近期，CrRLK1L家族的另外两个成员HERK1和ANJEA可能与FER形成异源复合物来调控花粉管的接收。NTA是Mildew Resistance Locus O家族的一个跨膜蛋白，FER对于在花粉管到达时NTA在丝状器上的重新定位是必须，暗示着NTA作用于FER的下游。EVN和TUN分别编码UDP-糖基转移酶超家族蛋白和多萜醇激酶，暗示着在助细胞的表达的N-糖基化蛋白能够在花粉管的接收中起作用。amc (abstinence by mutual consent)突变体仅仅在雌雄双方都缺失时才会出现花粉管不能正确接收的表型，这表明花粉管的接收需要雄配子体和雌配子体之间的相互作用，并且两种配子体共享一套信号传递的机制。在对于雄方的研究中发现三个MYB类的转录因子MYB97, MYB101和MYB120，这三个转录因子在花粉管穿过柱头后受诱导表达，单突或是双突都没有表型，在myb三突中，约70%的胚珠都出现花粉管缠绕在雌配子体上，并且无法释放出精细胞。这三个MYB类的转录因子和FER的关系目前还不清楚，并且FER的配体还没有找到。
在助细胞正确接收花粉管后，花粉管将会爆炸释放出两个精细胞。玉米中在助细胞表达的类防御素蛋白ZmES4可以与在花粉管内表达的钾离子通道KZM1相互作用并且诱导花粉管爆炸。在水稻中，定位于花粉管顶端的RURP(Ruptured Pollen tube)与钾离子通道HAK1相互作用来调控钾离子的稳态和花粉管细胞壁完整性。在拟南芥中，一个编码Ca2+泵的蛋白ACA9如果在花粉管内缺失，则会导致爆炸失败，但是aca9 的花粉管能够正常到达目的地。此外ANX1 ANX2 还有 BUDDHA’S PAPER SEAL 1 (BUPS1) BUPS2组成的受体复合物是维持花粉管细胞壁完整性的重要因子，这四个蛋白都属于CrRLK1L家族，在花粉管生长时，花粉管内分泌小肽RALF4和RALF19能够与该受体复合物结合，维持花粉管细胞壁的完整性，当花粉管生长至一定阶段时，胚珠分泌的小肽RALF34可以更高的亲和力竞争结合该受体复合物，使得花粉管爆炸。此外LLG2(LORELEI-LIKE-GPI ANCHORED PROTEIN）和LLG3可以作为BUPS1/2ANX1/2受体复合物的共受体存在，且在RALF4/19小肽存在的情况下，可以显著加强LLG2/3与BUPS1/2、ANX1/2受体胞外域之间的相互作用。MARIS属于RLCK8家族的成员，该突变体也展示花粉管提前爆炸的表型，暗示其也位于RALF4/19-BUPS1/2ANX1/2-LLG2/3的信号通路之中。
Pollen tube–synergid interactions mediate sperm release.
第五部分 精卵融合
随着花粉管的爆炸，一对物理上联系的精细胞被释放出来。但是在正式的精卵融合之前，通过活体成像的实验，发现精卵细胞在正式融合之前，会存在几分钟的停滞，这几分钟被认为是雌雄配子信号大量进行交流的时刻确保精卵融合正确进行。基于先前的研究，认为目前在拟南芥配子融合过程总共分为三步，首先是卵细胞分泌的小肽会使精细胞激活，激活后的精细胞会与卵细胞黏附，最后实现融合。
GEX2(GAMETE EXPRESSED 2)是精细胞特异表达的单次跨膜蛋白，其有一个filamin-repeat的结构域，并且在其他的物种中存在同源基因，gex2 突变体精细胞与卵细胞和中央细胞不能进行正常的粘附过程。突变体雄配子传递率较野生型下降1.9倍。目前GEX2在雌方的配体还没有发现。hap2(hapless 2)突变体精细胞不能与卵细胞和中央细胞融合，主要介导了融合的过程。HAP2的同源基因在除了真菌的真核生物中广泛存在，暗示着该蛋白可能在真核生物有性生殖早期就起到融合的功能。此外，结构的数据显示，在精卵融合过程中，HAP2功能类似于II类病毒融合蛋白，需要形成蛋白三聚体，将一个两亲性螺旋插入雌方膜中来与卵和中央细胞融合。由于在雄配子发育过程，营养细胞会将生殖细胞吞噬，所以精细胞会有双层膜的结构，所以外层的膜应该在精细胞膜膜融合之前裂解。此外由于两个精细胞之前还存在一个连接区域，这个区域应该在融合过程会裂解。EC1(egg cell-specific expressed genes)是一组定位于卵细胞的分泌型小肽，共有五个成员EC1.1-EC1.5,EC1小肽定位于卵细胞囊泡状的结构中，并且会从其中分泌到卵细胞外，引起精细胞中HAP2定位的改变完成对精细胞激活。利用EC1-RNAi的材料也发现精细胞的粘附过程也受阻，同时两个精细胞不分离，暗示了EC1功能的多样性。但是目前为止，EC1分泌的时间还不确定，此外EC1位于精细胞上的受体还未鉴定。近期还鉴定到两个精细胞定位的四次跨膜蛋白DMP8(DOMAIN OF UNKNOWN FUNCTION 679 membrane protein)和DMP9,并且主要是在融合过程中发挥作用，被认为可能主要起到保证HAP2正确发挥功能。
在融合过程，一个精细胞和卵细胞融合，一个与中央细胞融合，多精融合的概率也是非常低，暗示同样存在一种机制来确保精卵的正确融合。在动物中，该过程涉及快速的膜去极化，随后使得精子与合子隔离开。在植物当中，精卵融合的过程在雌雄配子中都会存在细胞质Ca2+浓度增加的现象，但是这是膜去极化的原因还是结果以及是否是真的用来阻止多精融合的过程，现在还不确定。
Fertilization-essential proteins acting on the membranes of Arabidopsis male and female gametes
至此被子植物已经从单倍体跨越到了二倍体，如果以上的步骤都顺利完成的话，那么他就有可能长成我们随处可见的花花草草。
主要参考文献（简单先列出文章名字）：
1.A Fruitful Journey: Pollen Tube Navigation from Germination to Fertilization
2.Cysteine-rich peptides: signals for pollen tube guidance, species isolation and beyond
3.Ligands Switch Model for Pollen-Tube Integrity and Burst
4.How CrRLK1L Receptor Complexes Perceive RALF Signals
5.Twice the fun, double the trouble: gamete interactions in flowering plants
网友评论