众所周知，实验并不是做出来就结束了，更重要的是我们要对结果进行分析统计，以得出实验的结果结论。要想获得理想的实验结果，标准的试验操作步骤是第一步，合适的分析方法是第二步。
免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）是利用抗原抗体反应已显示某蛋白的表达及定位的实验。这种实验的独特之处在于它既直观的显示了蛋白在组织及细胞或细胞亚结构的定位，又保留了组织样品的结构特征。IHC 已广泛应用于生物医学研究及临床诊断中。
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所以组织切片经免疫组化染色后，你真的知道选择什么样的方式分析吗？目前免疫组化尚无统一的标准计量方法，但已有几种科研界已被认可的 IHC 计量方法，下面我来一一详细介绍，小伙伴们拿起本本赶紧记录啦～
积分制
积分制是对切片以细胞染色强度、阳性细胞范围进行评分，再相乘得出最终得分的方式，这是最常用的方法。
标准评分为：
根据细胞染色强度评分为 4 级，无阳性着色（阴性）计 0 分，淡黄色（弱阳性）计 1 分，棕黄色（阳性）计 2 分，棕褐色（强阳性）计 3 分；
根据阳性细胞百分比评为 4 级，≤25% 计 1 分，26%-50% 计 2 分，51%-75% 计 3 分，＞75% 计 4 分，将两项评分相乘得出最终评分结果 [1-2]。
此种方法是最贴近临床方面的，小伙伴们如果想做某因子的临床病理特征分析，那最好采用这种方法。
参考文献：[1] 李明凤，方林娜，计翼，胡沛然，孙林，王悦晨，孙礼洁，尹玉。前列腺癌组织中 TEM8 与 VEGF 的表达及临床意义 [J]. 临床与实验病理学杂志，2020,36 (10):1144-1148.
参考文献：[2] Guo Zheng,Zhang Xiufang,Zhu Huabin et al. TELO2 induced progression of colorectal cancer by binding with RICTOR through mTORC2.[J] .Oncol Rep, 2020, undefined: undefined.
阳性细胞数
计数阳性细胞数适用于评估某物质是否在组织中存在以及数量，是对该物质数量而不是表达强弱的判别。
如评估某细胞在该组织中的数量，可利用该细胞的特异性标志物做免疫染色。如 CD163 标记 M2 型肿瘤相关巨噬细胞，CD34 标记血管内皮细胞，CD3 标记 T 细胞等等。
对于这类免疫组化，我们直接计数 20 倍镜下随机 5 个视野下的阳性细胞数，再求一个平均数即为这张片子的阳性细胞数。
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也有计算单位面积下阳性细胞数的方法。通过统计 20 倍镜下的细胞数，在除以镜下面积，得出细胞密度，单位为 cells/mm2。
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参考文献：[3] Zheng Shaoquan,Zou Yutian,Xie Xinhua et al. Development and validation of a stromal immune phenotype classifier for predicting immune activity and prognosis in triple-negative breast cancer.[J] .Int J Cancer, 2020, 147: 542-553.
Image Pro Plus 软件测量平均光密度值
有时，我们想定量的分析某因子的高低表达差异，用半定量的积分制并不能很好的区分差异，我们可使用软件进行统计分析。
Image Pro Plus 软件的计量原理是根据目的蛋白的着色深浅及分布面积来确定目的蛋白的表达量。大家在网上搜索 Image Pro Plus 的操作方法即可，简单上手。
百度上有篇关于 Image Pro Plus 软件分析免疫组化的超详细的文章，链接在此：
https://wenku.baidu.com/view/85c0cb4caf1ffc4fff47ac25.html。
通过测量出每张图片的累积光密度值（integrated option density, IOD）值以及区域面积 area 值，再计算出平均光密度值（mean density）即 mean density=IOD/area，此值反映了目标蛋白的单位面积浓度。最后取每个样本的 5 个随机区域 mean density 的平均值即为此样本的值。
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参考文献：[4] Wang Yang,Wu Caifang,Qin Yong et al. Multi-Angle Investigation of the Fractal Characteristics of Nanoscale Pores in the Lower Cambrian Niutitang Shale and Their Implications for CH Adsorption.[J] .J Nanosci Nanotechnol, 2021, 21: 156-167.
以上为 3 种免疫组织化学常用的计量方法，希望对大家免疫组化实验数据处理有所帮助，少走弯路。
具体选择哪种方法还是要根据你的研究内容和目的，最后祝大家早日发 SCI 呀～
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