流式细胞术（Flow cytometry）是一种广泛应用于生命科学研究和临床诊断的技术，它可以对液流中的单细胞进行快速、准确的定性和定量分析。在流式细胞仪中，样品被引入细胞通道，单个细胞通过激光束时，激光与细胞相互作用，产生多个散射光和荧光信号，这些信号被收集并转换为电信号，然后通过电子学系统进行放大、处理和分析。

通过使用不同的荧光染料或荧光标记抗体，可以对细胞表面标记物、细胞内容物、细胞活性等多个参数进行测量，这使得研究人员能够确定不同类型的细胞、细胞亚群或细胞状态。流式细胞分选已被广泛应用于免疫学、细胞生物学、肿瘤学、血液学等领域，随着单细胞测序技术的发展，以及研究维度的精细化需求，流式分选与单细胞测序的结合也将愈发紧密。

我们将流式分选方法简单分为特异性直标抗体分选和自发荧光分选两种，它们在目标细胞标记和分选原理上有所不同。

特异性直标抗体分选

原理：选择与目标抗原特异性结合的直标荧光抗体，将待分选的细胞样品与荧光标记抗体一起孵育，使抗体与细胞表面抗原特异性结合，通过流式细胞仪检测相应的荧光信号来识别和分选。

特异性直标抗体分选案例：小鼠-心脏-CD45分选

自发荧光分选

原理：通过基因工程技术使样本目的基因上融合荧光蛋白基因，如GFP/RFP基因等，流式细胞仪通过检测细胞内自发产生的荧光信号来识别和分选，这种方法适用于那些已经被转基因表达荧光蛋白的细胞或组织。

自发荧光分选案例：阳性细胞

如果实验目的在于研究没有特异性细胞表面标志物的细胞类型，通过自发荧光分选得到目的细胞，进行后续单细胞测序，比如分选得到血液中自发荧光阳性细胞、肺组织中的自发荧光阳性细胞，则可以通过常规胞质内的荧光蛋白表达，实现阳性细胞的分选。

01 样本类型——分群明显

空白组为野生型小鼠，未做特殊处理，明确不带荧光；实验组为GFP组，带自发荧光；流式分析可见明显分群。

02 样本类型——分群不明显

此类流式样本存在一定比例的假阳性、假阴性，需要科研人员对于实验熟悉程度高，可指导实验人员共同进行圈门操作。

03 样本类型——荧光丢失型

实验组和空白对照组的荧光强度几乎无差别，实验组发生了荧光淬灭等现象。

自发荧光分选案例：阳性细胞核

如果实验目的在于研究酶解较难得到且特殊关注的细胞类型，通过组织抽核后分选荧光蛋白阳性的细胞核，用于后续单细胞测序，比如脑、脊髓等神经元细胞的自发荧光阳性细胞，植物特殊细胞类型等，这种情况建议基因编辑时荧光蛋白带核定位信息，即荧光蛋白在核内存在，从而实现阳性细胞核的分选。

01 文献案例——小鼠肠道神经元细胞核

参考文献：Obata Y, Castaño Á, Fallesen TL, Bon-Frauches AC, Boeing S, Huseynova A, McCallum S, Lasrado R, Heanue TA, Pachnis V. Molecular profiling of enteric nervous system cell lineages. Nat Protoc. 2022 Aug;17(8):1789-1817. doi: 10.1038/s41596-022-00697-4. Epub 2022 Jun 8. PMID: 35676375.

02 文献案例——小鼠脑神经元细胞核

参考文献：Okada S, Saiwai H, Kumamaru H, Kubota K, Harada A, Yamaguchi M, Iwamoto Y, Ohkawa Y. Flow cytometric sorting of neuronal and glial nuclei from central nervous system tissue. J Cell Physiol. 2011 Feb;226(2):552-8. doi: 10.1002/jcp.22365. PMID: 20717962.

03 文献案例——植物特殊细胞类型细胞核

参考文献：Weinhofer I, Köhler C. Endosperm-specific chromatin profiling by fluorescence-activated nuclei sorting and ChIP-on-chip. Methods Mol Biol. 2014;1112:105-15. doi: 10.1007/978-1-62703-773-0_7. PMID: 24478010.

自发荧光分选-单细胞实验总结

注:自发荧光分选风险性较高，请谨慎选择