单细胞测序流程
单细胞测序流程(http://learn.gencore.bio.nyu.edu)
在过去的十多年里，高通量测序技术被广泛应用于生物和医学的各种领域，极大促进了相关的研究和应用。其中转录组测序（RNA-seq）被广泛应用于测定和描绘各类物种的基因或转录本的表达情况。但传统的转录组测序技术（bulk RNA-seq）是基于群体细胞，每个样本包含成千上万个细胞，所以最终反映的是基因在群体细胞中平均表达水平，从而掩盖了不同细胞之间的表达异质性。近年来，单细胞转录组测序（single-cell RNA-seq，scRNA-seq）技术得到了蓬勃的发展，从而使得可在单细胞水平揭示全基因组范围内所有基因的表达情况，非常有利于研究细胞间的表达异质性。目前单细胞转录组测序技术（scRNA-seq）已经广泛应用于各类物种（特别是人、小鼠等）的不同类型组织和细胞系，包括正常和病变细胞等。自从2009年等由汤富酬等人开发出了第一种单细胞转录组测序技术，目前已经有几十种不同的单细胞转录组测序技术相继被开发出来，它们都有各自的特点，拥有特定的优势和缺点。为了正确利用相应的单细胞测序技术开展相关研究和应用，非常有必要充分了解这些不同技术的优缺点。
图1、单细胞转录组测序技术的发展史(Svensson et al.NATURE PROTOCOLS, 2018)
细胞分离技术
进行单细胞测序前，首先需要分离单个的细胞，不同类型的单细胞转录组测序技术，使用的细胞分离技术可能不一样。总的来说，目前主要有以下几类细胞分离技术：
1）Micropipetting micromanipulation（口吸管技术）；
2）Laser capture microdissection（激光捕获显微切割技术）；
3）Fluorescence activated Cell Sorting，FACS（流式细胞仪技术）；
4）Microdroplets（微滴技术）；
5）Microfluidics（微流体技术）；
这几类技术的优缺点具体如下图所示
图2、单细胞转录组测序细胞分离技术分类及各自的优缺点(Kolodziejczyk et al. Molecular Cell, 2015)
单细胞测序技术
单细胞转录组测序技术种类根据测序捕获的转录本序列范围主要可分为：
1）测全长的转录本（full-length transcript sequencing）技术（如Smart-seq2、MATQ-seq 、SUPeR-seq等）；
优点：可测转录本的全长，检测基因表达更灵敏、更准确，可进行各种类型的转录组测序数据分析；
缺点：细胞通量少，价格较贵；
2）只测转录本 3′ 或5′ 端的（3′ 或5′-end sequencing）技术（如Drop-seq,、Seq-Well、Chromium 、 DroNC-seq、STRT-seq等）两大类。
优点：细胞通量高，价格便宜；
缺点：只测转录本的一端，检测基因表达灵敏度较低，不适合进行可变剪接、等位基因表达等分析。
目前已有的主要单细胞转录组测序技术具体如下表所示
表1、目前主要的单细胞转录组测序技术(Chen et al. Frontiers in Genetics, 2019)
不同类型的单细胞转录组测序技术检测基因表达的性能比较，结果显示Smart-seq、MARS-seq等单细胞转录组测序技术在检测基因表达时具有更高的准确性和灵敏性
1）单细胞和传统多细胞测序的基因表达检测相关性比较
图3、单细胞转录组测序技术检测的准确性（Svensson,Nature Methods, 2017）
2）不同单细胞转录组测序技术检测表达基因数量比较
图4、单细胞转录组测序技术检测的灵敏性（Svensson,Nature Methods, 2017）
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