表达质粒构建之引物设计

比如我现在需要表达FUS这个蛋白，首先我要确定FUS的CDS区序列，使用NCBI即可获得；

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可以看出FUS有三个同源异构体，我们以第一个X1为例来说明；

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这是其CDS区序列信息；
下面为编码蛋白信息

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我们一般设计引物格式为

F: 5‘-保护碱基+酶切位点+Kozak（可选）+ATG+一小段目的基因序列（一般18或21个碱基）
R：5‘-保护碱基+酶切位点+终止密码子+（如果你有要表达的标签序列）+一小段目的基因序列
注：终止密码子一般构建截短体的时候需要，详情请见“截短体引物设计”
如果我选择的内切酶是cla1 and kpn1

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Forword seq

FUS（Cla1）-F：CC ATCGAT GG ATG GCCTCAAACGATTAT

格式为：保护碱基+ATG(不需要可以加入，全序列前3个碱基均是起始密码子）+序列；

此处没加Kozak序列的原因是不想让引物太长，我们选择的细胞株中FUS高表达，不需要增强转录；

Reverse seq

FUS（Kpn1）-R：GG GGTACC CC TTAATACGGCCTCTCCCT
此处没有终止密码子的原因是，CDS区的最后含有终止密码子，所以直接是序列，截短体或者要扩增一个基因的特定区域序列则是要加终止密码子；