关键词

LFIA，QDs富集，介孔硅，检测血清β-淀粉样蛋白

文献信息

"Rational Design of Dendritic Mesoporous Silica Nanoparticles’ Surface Chemistry for Quantum Dot Enrichment and an Ultrasensitive Lateral Flow Immunoassay"

https://doi.org/10.1021/acsami.1c02149

ACS Appl. Mater. Interfaces 2021, 13, 21507−21515

第一通讯单位：昆士兰大学-余承忠

摘要

LFIA在即时诊断中的应用备受关注，高性能标签材料的开发是关键。在本研究中，研究了树枝状介孔二氧化硅纳米颗粒 (DMSNs) 的表面化学性质对其对量子点(QDs)的富集性能及其作为标记材料的信号放大的影响。合成了一系列氨基/巯基密度可控的DMSN。结果表明，由于氨基基表面钝化作用，氨基有利于量子点的荧光保存，而巯基则由于巯基-金属配位作用而增加了量子点的负载能力。优化后的DMSNs-QDs标签在氨基密度为153 umol/g和硫醇密度为218 umol/g时，QD荧光负载良好(89.4%)。血清超灵敏检测β-淀粉样蛋白SAA的肉眼检出限为10 pg/ml，比文献报道的结果提高了1个数量级。本研究为先进标记材料和超灵敏标记材料的发展提供了新的视角LFIA用于未来的生物测定应用。

摘要图.

结果与讨论

TEM 和 SEM 对 DMSNs 的形貌进行了表征，TEM和SEM图像显示DMSNs内表面具有较大的开放孔道，表明DMSNs的QD固定化具有较高的可行性 (图S1a,b)， TEM和动态光散射(DLS)分析得到的DMSNs的粒径分布分别为365.9±23.9和438.5±22.0 nm (图S1c,d)。多分散性指数(PDI)为0.18±0.05，表明DMSN具有良好的单分散性(图S1d)。A-T- DMSNs采用APTES和MPTMS作为前驱体的接枝策略，在DMSNs表面获得高密度的氨基和巯基。本文采用的商用TOPO/ OA封顶CdSe/ZnS量子点直径为14.9±0.2 nm，发射波长为617 nm (图S2)。

Scheme 1. Schematic Illustration of (a) the QD Fluorescence Preservation, QDs Loading, and Ligand Exchange Mechanism ofQD-Loaded A-T-DMSN (A-T-DMSNs-QD) Labels and (b) the Design of a DMSNs-QD-Based LFIA Test Strip for theDetection of SAA

通过结合氨基表面钝化、硫醇金属配位驱动组装、和配体交换策略(Scheme 1a)的简单超声方法制备了高荧光水分散A -153- T -218- QC。TEM图中的黑点直接证明了A-153-T-218中量子点的成功负载 (图1a)。图1b的高分辨率TEM (HRTEM)图像显示了A-153- T -218- QC /中量子点的晶格，测得的晶格d-spacing为3.3 A(图1b)，对应于纤锌矿(WZ)ZnS的100面。4S/图S3为粉末x射线衍射(XRD)测定的A-153-T218-QC晶体结构passivation35量子点的XRD谱图(蓝色曲线)与量子点的XRD谱图(红色曲线)相似，表明加载后量子点的晶体结构完整。/此外，A-153-T-218衍生的无定形二氧化硅的XRD峰(中心在23°) (紫色曲线)在T-218-A-153-QC中不明显，说明QD掺入密度较高。

Figure 1. (a) TEM, (b) HRTEM, and (c) high-angle annular darkfield scanning transmission electron microscopy (HAADF-STEM)images and energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS)-elementalmapping of A-153-T-218-QC. The inset in (b) shows a lattice spacingof 3.3 Å for the WZ-ZnS (100) plane.

利用能量色散x射线能谱(EDS)结合高角度环形暗场扫描透射电镜(HAADFSTEM)的元素作图方法研究了A-153-T-218中量子点的分布(数字代表功能基团的密度)。图1c为A-153T-218-QC的HAADF-STEM图像。Si, S, N(来自A-153-T-218)和Se, Cd, Zn, S(来自量子点)的EDS元素映射图像显示了相似的均匀分布，表明量子点在二氧化硅基质中具有高负载(图1c)。A-153-T-218量子点富集前后的吸氮等温线如图S4所示。在相对压力(P/ Po)为>0.9的范围内，A -153- t -218的毛细管缩合台阶陡峭，对应的平均巴氏孔径为58.2 nm(图S4的嵌段)。量子点在A -153- T- 218中的富集导致BJH平均孔径减小到47.3 nm(图S4的插图)，比表面积从401减少到240 m2/g，总孔体积从2.00减少到1.06 cm3/g，表明A -153- T- 218具有较高的量子点负载。

为了研究DMSNs的表面功能对量子点负载和荧光保存的影响，制备了一系列不同NH2和SH密度的DMSNs, A -D- T -D 的合成细节和APTES在氨基和巯基修饰中的催化机制可以在S1 (图S5)。简而言之，二氧化硅表面改性的氨基和巯基的密度可以通过改变APTES的数量，同时固定其他参数(例如MPTMS/ DMSN的数量)。如图2a和表1所示，通过将MPTMS的量固定在当APTES与MPTMS的摩尔比从0.0625增加到0.25时，荧光剂法测定的氨基基密度从97.7 mu增加到257.7 mu (mol/g 图2a, S6, 表1)。当 APTES 与 MPTMS 的摩尔比从0增加到0.125时，相应的巯基密度(Ellman试验测定)从29.4 umol/g 增加到 217.6 umol/g。这是由于胺在硅酰化反应中的烟熏催化作用所致，表明进一步增加摩尔比。将硫醇密度降低到173.5 umol/g，可能是由于APTES优于MPTMS的表面改性。通过x射线光电子能谱(XPS)对氨基和巯基的表面密度也进行了表征，如图2b、c和表1所示，氮的重量百分比从1.12增加到2.39，而硫的重量百分比从1.58增加到2.14，然后下降到1.98，其趋势与荧光试剂和Ellman试验的测量结果一致。

Figure 2. (a) Relationship between the density of thiol/amino groups on DMSNs and the molar ratio of APTES to MPTMS. High-resolution XPSspectra of (b) nitrogen and (c) sulfur elements of A-T-DMSNs prepared with different molar ratios of APTES to MPTMS.

A-98-T-135、A-153-T-218和A-258T-173(图S7a-c)的TEM图像显示，改性后的DMSN结构保持良好。水动力粒径分布如图S7d-f所示，pdi较低，表明其在水中具有良好的分散性。修饰后dmns的ζ电位由负电荷(-35.44±2.04 mV)变为正电荷(34.68±1.34 mV、53.65±2.16 mV、47.46±1.77 mV)表明氨基修饰成功，与以往文献报道一致。

利用不同氨基和硫醇密度的A-T-DMSNs进行量子点富集，利用电感耦合等离子体-光学发射光谱(ICP-OES)对量子点的负载能力进行定量。如图S8所示，当QDs/ A -153- T -218的投料比增加到5 时，QDs的加载达到一个平台，并将该浓度用于其他样品的加载试验。作为对照，合成了与A -153- T -218相似的单氨基(A -153)或巯基(T-227)密度的DMSN进行比较。详细的XPS、TEM和DLS表征见图S9和S10。A-153是用前面描述的相同方法制备的。然而，同样的方法得到的T-DMSNs的巯基密度仅为29 umol/g。这是因为MPTMS在无水环境中的改性受到APTES缺失的制约。因此，T-277是在乙醇/水溶剂中以氨为催化剂合成的(表1)。

如图3a和表S1所示，A-153、A-98-T-135、A-258-T-173、A-153- t -218和T-227的QD装载能力由高到低依次为0.33、0.99、1.18、1.55和1.60 g g-，分别为)，与硫醇密度正相关。与A -98- T - 135QC、A -258- T -173- QC、A -153- T -218- QC和T-227-QC相比，A -153- QC的TEM图像显示DMSN中分布的QD密度较低(图S11和3b)。同时，三种样品的SEM图像也显示，A -153- QC相比 A -153- T -218- QC 和 T-227-QC有更多裸露的多孔表面 (图3b)。这些结果表明，提高改性 DMSN 的硫醇密度是提高量子点负载能力的关键。

我们进一步研究了表面功能对量子点荧光保存的影响。测量了T-227-Q、A-98-T-135-Q、A-153-T-218-Q、A-258-T173-Q和a -153- q中量子点的荧光强度，并与游离量子点进行了比较。结果表明，DMSN 中氨基的存在可以保持更强的荧光强度(图S12)即使在配体交换后(图3c和表S2)， A-98-T135-QC、A-153-T-218-QC、A-258-T-173-QC和A-153-QC的荧光保存率分别为87.6、89.4、92.3和99.0%，均高于T-227-QC的荧光保存率(79.2%)。这与文献中在室温下加入烷基胺增强量子点荧光的研究结果一致，表明氨基可以有效地钝化表面陷阱位点。此外，还测量了原始量子点和五个样品的荧光衰变。荧光衰减曲线采用双指数衰减函数进行拟合，其卡方减小值大于0.97(图S13)。A98-T-135-QC, A-153-T-218-QC, A-258-T中量子点的计算平均寿命为2.94 ns, A-153-T-218-QC为3.12 ns

173-QC (3.17 ns)和A-153-QC (3.18 ns，在去离子水中保存3个月)与原始QDs (3.25 ns)接近，但比T-277QC中的QDs (2.78 ns，图S13)长，这与5个样品的荧光强度变化趋势一致，进一步证明了表面陷阱可以被氨基钝化。此外，本文采用的3-MPA配体交换策略使疏水性DMSNs-QDs快速转移到水相中，QD荧光牺牲小，且各基团的荧光保有率(>75%)均高于文献报道的需要硅溶胶封装策略时的荧光保有率(6518和45.9%31)。

标记材料的荧光强度对LFIA的检测灵敏度起着重要作用，其检测灵敏度由量子点的负载能力和荧光保存率共同决定。如图3d所示，同时含有巯基和氨基的A-153-T218-QC由于具有较高的QD负载能力(1.55 g g-)和足够的QD荧光保持性(89.4%)，在五组中荧光强度最高。/还计算了样品在单颗粒水平的荧光强度。和SH /基于氨基密度(表1),QD的承载能力比- 153 qc / t - 98 - 135 qc / t - 258 - 173 qc / t - 153 - 218 qc / t - 277 - qc 级别的计算是0.20:0.62:0.75:0.98:1.00结合荧光保护比率(图3 c),荧光强度比的单粒子水平- 153 qc / t - 98 - 135 qc / t - 258 - 173 qc / t - 153 - 218 - qc / T277-QC:0.62:0.79:1.00:0.90计算是0.23,其趋势与图3d中提供的数据相同。

Figure 3. (a) QDs loading amount of A-T-DMSNs; (b) TEM andSEM images of A-153-T-218-QC, A-153-QC, and T-227-QC; and (c)fluorescence preservation and (d) fluorescence intensity of modifiedDMSNs-QC nanocomposites. Fluorescence intensity = QD loadingamount × fluorescence preservation rate. “**” represents p ≤ 0.01and “***” p ≤ 0.001.

上述结果表明，巯基和氨基在DMSNs上的表面修饰对于LFIA标签材料的开发非常重要(图4a):巯基和a -153- t -218- q用一个S2p双联装面积比为2:1，分裂为1.2 eV。A-153-T-218中量子点的固定导致未结合的烷基硫醇峰在163.3 eV消失，而在T-218-A-153-Q中出现了161.4 eV的峰，代表了量子点的结合硫化物和金属硫化物XPS结果表明DMSNs上修饰的巯基参与了QD表面Cd/Zn原子的配位，这与文献一致。因此，增加巯基密度导致更高的QD加载能力(图3a)。其次，如图4c CP-MAS NMR谱所示，A-153-T-218-Q和A-153-T-218-QC中分配给量子点的峰强度(例如，烯烃碳9和10在130.4 ppm时)下降，表明巯基和氨基对原始TOPO和OA配体进行了部分交换。在水分散DMSNs-QDs的合成过程中，QD的加载和相转移步骤不可避免地导致原始TOPO/OA配体被巯基和/或氨基部分交换，引入表面陷阱，降低QDs的荧光效率氨基可以将电子捐赠给表面电子陷阱，并通过陷阱减少电荷重组，从而保留量子点的荧光，这也在我们的结果中观察到(图3c)。

Figure 4. (a) Schematic illustration of the surface chemistry of QDsin A-153-T-218-Q and A-153-T-218-QC. (b) High-resolution XPSspectra of the sulfur element of A-153-T-218, QDs, and A-153-T-218-Q. (c) Solid-state 13C CP-MAS NMR spectra of A-153-T-218, QDs,A-153-T-218-Q, and A-153-T-218-QC.

标签颗粒的水分散性决定了其流动能力，从而极大地影响了LFIA的成功和再现性。在这项工作中，用DLS和ζ-势分析研究了A/ T-QC的水分散性。选取所有A/T-QC样品中荧光强度最高的/A-153- t -218- qc，以A153-QC和T-227-QC作为对照。/如图S14a-c所示，A-153-T-218-QC、A-153-QC和T-227-QC的水动力尺寸分别为471.9±7.2 nm、484.3±6.1 nm和463.2±8.7 nm。/低pdi为0.11±0.05,0.11±0.07、0.13±0.07分别为较好的单分散性。所有样品在去DI水中都观察到明显的廷德尔效应(图S14a-c的插图)，表明它们具有良好的胶体稳定性。与此同时，A/T-QC相对应的ζ相势为-55.85 ± 0.70、-27.41 ± 2.06 和 -72.97 ± 4.95，(图S14d)，进一步证实了COOH基团的成功掺入。此外，所有的ζ电位值都在-25 mV以下，表明具有高度的胶体稳定性

为了研究其作为LFIA荧光标记的性能，将A/T-QC与抗SAA第二单克隆抗体偶联(记为I-A/T-QC)，然后应用于SAA检测，SAA是主要的急性期蛋白；SAA值的敏感、准确定量对监测疾病进展和治疗效果具有临床意义。将含有SAA标准样品和I-A/T-QC的预混合溶液100 μL滴入样品垫(方案1b)。由SAA和I-A/T- qc组成的免疫复合物在毛细管力的驱动下沿条带迁移，并被T系中预固定的抗SAA 1单抗捕获。特异性抗原-抗体相互作用形成IA/T- qc /SAA/anti-SAA 1号单抗夹心结构，在T系上产生一条荧光带。过量的I-A/TQC进一步迁移，并在C系中被预固定的GAM识别，产生另一条荧光带，表明个体测试的有效性。在紫外照射下拍摄LFIA条带的荧光图像start在365纳米处。T线处综合面积的信号比C系(Sr/Sc)用Image J定量。

首先优化了I-A/T-QC的工作浓度，以确保在LFIA上显示出强烈的荧光而没有假阳性结果。如图S15所示，I-A-153-T-218-QC、I-A153-QC和I-T-227-QC的最佳工作浓度分别为20、60和20 μg mL-1。然后，通过检测0-10 ng/mL范围内的SAA来评估这些I-A/ tqc标记的LFIA条带的检测灵敏度。如图Sa-c所示，所有的LFIA条带在荧光C线下均显示有效结果。一般来说，随着SAA浓度从0到10 ng/mL(用PBS稀释)的增加，T线的亮度增强。I-A-153-T-218-QC在10 pg/mL肉眼检测灵敏度优于IA-153-QC (500 pg/mL)和I-T-227-QC (50 pg/mL)，这是因为与A-153和T-227相比，A-153- T -218同时含有氨基和巯基，同时具有足够的QD荧光保留和高QD负载，因此在LFIA应用中具有最高的荧光强度和最佳的性能。值得注意的是，与报道的/商业的LFIA条带和酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒相比，目前的测定方法对SAA分析具有更高的敏感性(表S3)。图5d-g表示SAA浓度与相应Sr/Sc值的定量关系。Sr/Sc值随SAA浓度的增加而增大(图Sd,e)，可用于SAA在0-10 ng/mL范围内的定量。I-A-153-T-218-QC的Sr/Sc值与SAA浓度在0 ~ 2.5 ng/mL之间呈线性关系(图Sf)，而I-A-153-QC的线性范围为0 ~ 10 ng/mL(图5g)。

Figure 5. I-A/T-QC-based LFIA for sensitive SAA detection. Fluorescence images of test strips for (a) I-A-153-T-218-QC (20 μg/mL), (b) I-A153-QC (60 μg mL/mL), and (c) I-T-227-QC (20 μg/mL) in the presence of 0, 0.01, 0.05, 0.5, 1, 2.5, 5, 7.5, and 10 ng mL−1 SAA. Therelationship between the fluorescence signal and the SAA concentration from 0.01 to 10 ng mL−1 for (d) I-A-153-T-218-QC- and (e) I-T-227-QCbased LFIA. The linear response of (f) I-A-153-T-218-QC- and (g) I-A-153-QC-based LFIA for SAA detection in concentration ranges of 0.01−2.5ng mL−1 for (f) and 0.5−10 ng mL−1 for (g).

通过对人血清中SAA的检测，验证了I - A -153- T -218- QC标记的LFIA用于真实样品检测的可行性。如图6a所示，所有I-A-153-T-218-QC标记的LFIA条带在荧光C线下显示有效结果，且T线的亮度随着SAA浓度的增加而相应增加。根据SAA浓度与相应Sr/Sc值的定量关系，估计出0-10 ng/mL的定量范围(图6b)和0-2.5 ng/mL的线性范围(图6c)。I- A -153- T - 218QC标记的LFIA的特异性使用多种蛋白质作为干扰物进行评估，包括CRP、癌胚抗原(CEA)、人α胎蛋白(AFP)、前列腺特异性抗原(PSA)和人血清白蛋白(HSA)。如图6 d 所示，在各种干扰存在的情况下，I - A -153- T -218- QC标记的LFIA没有产生可检测信号蛋白质的浓度是SAA的100倍。相反，即使存在高浓度的混合干扰蛋白，低丰度SAA (1 ng/mL)也能产生清晰的荧光T线，这表明I -A-153-T-218- QC标记的LFIA对SAA具有较高的特异性。这些结果表明了当前方法在SAA诊断中的临床应用潜力。

Figure 6. (a) Fluorescence photographs of test strips for I-A-153-T-218-QC in the presence of 0, 0.01, 0.05, 0.5, 1, 2.5, 5, 7.5, and 10 ng mL−1 SAAin human serum. (b) The relationship between the fluorescence signal of ST/SC and the SAA concentration from 0.01 to 10 ng mL−1. (c) I-A-153-T-218-QC-labeled LFIA linear response for SAA detection in the concentration range of 0.01−2.5 ng mL−1 in human serum. Error bars indicatethe standard errors of three independent experiments. (d) Fluorescence photographs of the I-A-153-T-218-QC-labeled LFIA for various proteinanalytes (100 ng mL−1) for specificity evaluation.

研究结论

综上所述，研究了氨基和巯基修饰DMSN对QD富集和荧光保存的影响。高质量的DMSNs-QD标签具有89.4%的高荧光保留率，高QD负载(1.55 g g-1)，具有良好的水分散性。在浓度为10 pg/mL的情况下，用肉眼进行SAA的超灵敏检测，灵敏度是文献结果的10倍。从这项工作中产生的知识可以应用于LFIA应用的高性能标签材料的合理设计。