自噬研究方法工具汇总
转自Autophagy公众号
细胞自噬
细胞自噬(autophagy)是依赖溶酶体途径对胞质蛋白和细胞器进行降解的一种过程。这个过程可以清除功能异常的细胞器、细胞内病原体以及再循环细胞组分。尽管自噬最早被发现是应答饥饿，现在发现自噬受到各种胁迫信号的诱导，基础水平的自噬有利于细胞内稳态的维持。很多因素包括激素刺激的天然免疫信号及能量耗尽或高温等引起的物理胁迫会诱导自噬上调。相反，很多疾病如癌症、传染性疾病和神经退行性疾病及衰老和自噬的下调都有关联。
自噬主要有三种信号通路：
● Microautophagy小自噬通过溶酶体的膜内陷“吞入”目标分子，起到降解细胞质中小体积物质的作用。这个过程研究得不是很清楚，膜内陷相关的GTPaseVps1p蛋白和自噬相关蛋白(Atg)参与其中。
● 分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediatedautophagy,CMA)直接将细胞质蛋白带到溶酶体。带KFERQ-序列的蛋白质和热休克蛋白Hsc70及其它分子伴侣相互作用形成的复合体和溶酶体膜上的Lamp-2A受体结合后，导致Lamp-2A聚合引发复合体中的底物易位穿越溶酶体膜。
● Macroautophagy大自噬被研究得最多，可以降解更大量的胞浆物质，由特殊的细胞器自噬小体介导。大自噬起始于吞噬泡装配点（PAS）的形成和Unc51-likekinase (Ulk)复合体的组装，这启动了自噬小体的形成（图1）。接着是成核阶段，Ulk复合物与由beclin-1、Vps15、Vps34、Atg14组成classIII PI3K复合物相互作用形成吞噬泡。接着吞噬泡膜扩展形成自噬小体，在这个过程中Atg12/5/16复合物促成了磷脂酰乙醇胺（PE）和LC3（酵母中是Atg8）的偶联，这是自噬小体膜唯一已知的标志物。PE-LC3偶联物在几个关键步骤中起作用：自噬泡膜的扩展、自噬体的识别及自噬溶酶体的形成。整个过程涉及30多个自噬相关基因（Atg蛋白），包括Beclin-1、溶酶体相关膜蛋白(Lamp-1 and Lamp-2)和微管相关蛋白1A/1Blight chains 3A/B (MAP1LC3A/B 或简称LC3)，这些都是自噬常见的标志物。最后一步，完全形成的自噬小体与溶酶体融合释放内含的物质被降解。
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图1.自噬细胞信号通路
如何检测自噬？
● Microautophagy小自噬研究的工具有限，最常用的就是用电子显微镜观察溶酶体膜内陷形成的囊泡。
● Chaperone-mediated autophagy (CMA) 被研究得较多，三种分子伴侣lys-Hsc70、膜相关Hsc70和lys-Hsp90有积极参与，作为CMA底物受体的膜蛋白Lamp-2A的水平可以用来评估CMA的活力，Lamp-2A 和Hsc70的共定位可以用来识别CMA-active溶酶体。另外对于CMA底物的评估可参考以下方面：
- KFERQ-like targeting motif是否出现
2.与lys-Hsc70–positive溶酶体相关联
3.溶酶体活力依赖的降解速度
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与细胞质Hsc70的相互作用
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与Lamp-2A胞内区域相互作用;
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Lamp-2A活力相关的浓度;
7.易位到纯化的溶酶体中的能力
● Macroautophagy大自噬的评估最好使用多个自噬阶段的标志物。因为自噬小体数量的增加可能是自噬上调也可能是自噬最后阶段被抑制，所以放置合适的对照能说明得更清楚。
1.电子显微镜
透射电镜术(TEM)被广泛用于检测自噬过程中形成的各种结构，从吞噬泡到自噬小体到自噬溶酶体，但这个技术对使用者操作要求较高，且不能准确定量。
2.检测标志物 LC3/Atg8和 p62/SQSTM1
微管相关蛋白 1A/1B light chains 3A/LC3A 和 3B/LC3B (MAP1LC3A/B), 通常简称LC3 或酵母中称Atg8，是自噬小体最可靠的标志物。
在自噬过程中，非激活型胞质LC3 (LC3-I) 经过水解和脂质化后转变为激活的自噬小体膜结合LC3-II。通过Western Blot可以观察到更小的 LC3-II 条带（图2), 或者通过免疫荧光或免疫组化，可观察到 LC3从胞浆转移到膜结构上（图2)。提示，自噬活跃时，LC3-II的水平也可能低，因为自噬小体与自噬溶酶体融合后LC3-II会被降解。另外某些anti-LC3抗体识别LC3-I和LC3-II灵敏度上有差异，且LC3-I对于反复冻融和降解更敏感即使在SDS上样缓冲液中，因此样品要立即煮沸使用而不要反复冻融。
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图2. Identification of autophagy bywestern blotting and fluorescence microscopy.Conversion of LC3-I to LC3-II can be monitored by westernblot (A) and fluorescence microscopy (B).
p62 降解是另一个常用的标志物，它在自噬清除多泛素化蛋白时会被优先降解。自噬过程中LC3和p62的转录也会被调节，因此除了检测LC3和p62的降解，还需加上其它检测。
3.检测Lamps, Atg5,Atg14, and Beclin-1
针对溶酶体标志物Lamp-1 和 Lamp-2,或吞噬泡及自噬小体的标志物 Atg5,Atg14,Beclin-1的抗体经常被用在免疫荧光显微镜上、western blot及流式细胞仪上追踪自噬过程的进展。Lamp-2的检测 (图3) 应该与LC3-II检测联用，因Atg14也与ER关联它的检测也需要与其它标志物检测联用。
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图3.Identification of Lamp-2–positivecells by flow cytometry Mouse peritoneal macrophagesstained with FITC-labeled rat anti-mouseLamp-2 antibody following permeabilizationwith Leucoperm™ Accessory Reagent. The Lamp-2 positive cellpopulation is highlighted in red.
4.组织蛋白酶 Cathepsin活力检测
荧光标记的组织蛋白酶底物可通过报告cathepsin B, K，L的蛋白酶活力来发现活细胞中的溶酶体。这些可渗透细胞的无毒的试剂加入到细胞中被cathepsin降解后产生荧光物质(图4)，与细胞核染料如Hoechst及溶酶体和细胞器标志物如acridine·orange联用，可检测自噬水平。这些检测方法兼容荧光显微镜和酶标仪。
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图4.Identification of lysosomes byfluorescence microcopy Intracellular cathepsin Kactivity activity is detected in THP-1 cells using Magic Red Cathepsin K Kit.
5.检测自噬潮autophagic flux
因为自噬是一个动态的过程，自噬潮是一个动态连续的概念，涵盖了自噬体的形成、自噬性底物向溶酶体的运送以及在溶酶体内降解的整个过程，对这整个过程进行监测较单纯定量自噬小体的数量更能反映自噬活性。
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最后小编提醒大家，自噬和凋亡的关系很密切，例如cathepsins 和 Beclin-1也介导凋亡的过程，因此建议大家多使用一些标志物检测以避免得到错误的结论。
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