二代测序原理
Illumina：二代测序公司
Illumina-NGS： NGS是测一大堆不确定的序列，把这些序列加上特定的接头，用特定的接头来连到测序芯片的基板上，用接头的特定序列来引导边合成边测序的反应，用接头上的Index序列来区分样本。
几个基本概念
lane： 测序反应的平行泳道，试剂添加、洗脱等过程的发生位置
tile： 每次荧光扫描的位置，肉眼是看不到的
双端测序： 可能序列比较长有四五百bp，两边各测120-150bp
junction： 双端测序中间一些没有测到的区域
flowcell构造：一个lane包含两列（swath），每一列有60个tile，每个tile会种下不同的cluster，每个tile在一次循环中会拍照4次（每个碱基一次）
素材来源：
陈巍基因：<u>https://www.bilibili.com/video/BV1oJ411r7e7?spm_id_from=333.337.search-card.all.click</u>
总结的超棒《生信星球》<u>测序的世界 - 简书 (jianshu.com)</u>
1.芯片
Flowcell是拥有8条通道的载玻片，其上以共价键（只有这种连接才不会被洗脱）附有两种DNA引物，可抓捕DNA文库中带有两种接头序列的互补DNA。所有的核心反应将在其上进行（关于DNA文库，了解Truseq和Nextera试剂盒）。
测序前样本的文库扩增：超声打断基因组DNA，残端用特定的酶补齐，在两条非同义链末端用Klenow酶分别加一个A碱基，再用DNA连接酶把特定的已知接头序列（adaptors 有4个模块）安装在A末端，然后进行PCR浓度扩增，构成单链DNA文库。——称之为文库。即Library
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2.建立桥式PCR
目的在于把DNA文库在种在芯片上，进行扩增（一开始只是贴上去基因组原DNA片段的很容易被洗掉），以便于后续有足够强度的荧光识别信号。
接种，加入dNTP和DNA聚合酶→合成互补链（不仅文库被合成，另一端的引物序列也会被合成）→NaOH溶液解链后（非共价键结合在芯片上的模板链被洗脱）互补链的另一端与芯片上的另一种引物结合，形成桥→中和溶液将NaOH中和掉，加入dNTP和DNA聚合酶再次合成双链→再加NaOH溶液解链。指数扩增DNA文库。
重复上述过程。
完成后，在桥式双链解开后为正反链均存在的单链后，“特殊酶”将反向链切断、NaOH洗去反向链，留下正向链和反向链的共价键序列接头在芯片上（因为测序不能识别正反双链，只能识别单链）。同时为防止特异性结合重新形成单链桥，3‘端被封锁。
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目的是快速扩增lane p7接头连接的链，也就是****上****图中的Forward Strand，它和我们的模版链是一致的。****我们后来测序只用这一半
3.测序
小结：R****ead1 product边合成边测序：先是primer结合到靠近p5的sequencing primer binding site1上，再加入特殊的dNTP延长并测序。
接着进行****Index测序： 上面的循环结束后，read product被冲掉，index1 primer和链上的index1 互补配对，进行index1的检测。测完后，洗脱产物，得到index1 的序列。接下来p5与lane上的p5‘配对，测得了index2，并洗脱。
双端测序之Reverse Strand： 洗脱掉index2 产物后，还是一个桥式扩增，得到双链，再变性得到原始Forward strand 和 新的Reverse Strand， 除去测完的Forward strand。然后和测Forward一样，也是先连接primer，只是连接的位点是Primer Binding Site2，测完后得到reverse strand序列。都只是测150-200bp，而真正片段可能有500bp或更长。
具体：
加dNTP（荧光标记、3‘端带叠氮基，导致不能延长），加DNA聚合酶，这样每次合成只能延长一个碱基而不是都挤上去这样测不过来。用水冲掉多余反应物，进行激光扫描，即可读出一个碱基，即合成一节看一个。
激光扫描后，将叠氮基（可以接着它加下一个碱基）和荧光（避免下次扫描影响数据读取）切掉，继续上述步骤。当读取结束时通过一个二脱氧核苷酸终止于一条模版链终端位置。[图片上传失败...(image-1cfedc-1652629791786)]
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20个微孔彩色亮点代表20个序列一致的clusters，如果不进行35个循环，那就是很弱的亮点，但也是20个
4.读取条形码（index，也叫做Barcode 是在构建DNA文库时接头序列中的一段特定序列。拗口...）
index存在的意义是样本中DNA数量级很高几亿条 有时候不需要测那么多量，为减少成本，就用这个index来标记样本的来源****。
先把读取read1后的（测序引物+dNTP）“荧光链”碱性液解链后冲掉，加入中性液read2测序引物，read2测序引物识别的Read2 位置正好就在index旁边，一般测序识别6-8个碱基，这样就可以知道某一段DNA来自原始的哪个样本。
注：不同的测序机器原理都差不多，都是将接头序列提前共价键装载与固体材料上，
然后通过扩增产生DNA簇，每个簇都来自单独的DNA文库，每种簇又作为单独的测序反应，因此来识别不同样本来源的DNA。
补充：
1、（不太懂）关于测序文库的长度，是可以在建库时调整的。
如果想要得到数据是对基因组更加多的区域的覆盖，那就用插入片段为350BP这样的长的文库，这样测到的序列，在一个文库分子内部，就不太会是重复的。
也有一些测序的目的，是要测到单个文库分子内部的长的、连续的序列，这可以做插入片段短一些的文库，比如建一个插入片段是150180BP的文库，这样中间有2050个碱基是交叠的，就可以通过生物信息学分析，得到一个更长的分子片段的序列
2、如果是illumina双端测序，不需要两端都有index，一端有就可以了。****（****相悖****）
3、有时候会产生Phasing：再延长时DNA聚合酶活性差，dNTP连接不上去了，越合成质量越差。有时候有的合成会很超前即Prephasing：由于dNTP3’端的叠氮基团掉了，下面的dNTP又结合上去。在测序过程中phasing 和prephasing 是限制测序循环最主要的原因。也就是说随着循环的增加，越来越多的分子“掉队”越来越多的分子“超前”，所以导致噪音信号比实际测得信号强了，这时候测序就不准了。
4、Chastity ：当出现荧光信号重叠的时候，为了证明这个荧光信号属于哪种（测其纯粹程度），通俗来讲：A比B的荧光信号强1.5倍那就说明是质量好的荧光。我们通常测前25个碱基的chastity，来判断这条链的测得荧光质量好不好。也就是pass filter即PF data，PF率。我们所说的PF率就是质量合格的reads数/总reads，也可以侧面反应测序的质量。
5、Quality score：是判读一个碱基质量的分数，有点像黄金纯度比，Q30——99.9%（出错的可能性为千分之一），Q40——99.99%（出错的可能性为万分之一）。Q30比例是指 在所有PF数据中达到或超过Q30的数据占所有PF数据的比例。
总数据
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上述也就是将Quality Score转换成ASCII码 （也就是堆图形），并生成以下的FastQ文件。
HiSeq工作原理
Hiseq是高精度光学显微镜，由计算机软硬件、温控系统、显微仪器组成。其中最复杂的就是内部光学系统。
1、tiff.文件 每次扫描完都会出现一张这样的图片，但是文件太大不易于储存。
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2、BCL.光点文件
小tips：每4个图片合成为1张图片，但在PCR文库扩增时某一碱基数量特别多，就会使计算机识别时发生困难，无法识别其他3张暗淡的两点点。解决办法是掺入人全基因组DNA中和一下或者Illumina特质的基因，使光点均匀起来。
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如果客户是包有Lane和flowcell的项目，公司是会提供BCL.文件的，通过用BCL2FSTQ软件将BCL.文件转化为FASTQ.文件进行验证测序公司提供的数据是否是原始且真实的。
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