项目文章 | Nature Cell Biology—利用LAC

6月9日，中国科学院生物物理研究所薛愿超课题组在期刊《Nature Cell Biology》上发表了题为“Global profiling of RNA-binding protein target sites by LACE-seq”的研究论文。该研究提出LACE-seq方法，可在微量细胞中鉴定RBP的作用靶点，首次实现了在单碱基分辨率和单细胞层面精准鉴定RBP的结合位点。该技术的提出为RBP在胚胎发育和生殖疾病中作用的研究打开了大门，并为各种疾病和健康细胞中RNA调控网络的发现打下了基础。

由于卵母细胞和早期胚胎细胞无法增殖，在这些稀有细胞中识别蛋白质与 RNA的相互作用位点非常困难。作为一种主要RBP靶点鉴定方法，交联免疫沉淀测序(CLIP-seq)技术步骤复杂，且需要上万个细胞作为样本。TRIBE等技术虽然可以降低对细胞数量的要求，但TRIBE的鉴定精度低，而且经常脱靶。因此，从少量细胞中鉴定蛋白质与RNA的相互作用仍然是一个巨大的技术挑战。

为了解决这一问题，该研究提出了一种LACE-seq技术，该技术借助RBP介导的免疫纯化蛋白与RNA复合物的逆转录终止作用，对终止后产生的cDNA末端进行扩增，随后对产物进行高通量测序及分析。评估后发现LACE-seq可以敏感地捕获少量细胞中低表达的靶点，直接识别功能蛋白与RNA的相互作用。此外与几种基于CLIP的方法相比，LACE-seq在灵敏度、准确性、精密度和周期等方面均占优势。利用LACE-seq技术，可以在少量甚至单个的卵母细胞中识别Argonaute家族蛋白Ago2和Mili等的具体靶标。

LACE-seq方法原理图（图片引自文献[1]）

进一步研究发现，Argonaute家族蛋白Ago2和内源siRNA可以相互作用形成复合物，Ago2/endo-siRNA复合物能够与LTR驱动的嵌合转录本互作，诱导其切割降解，从而抑制转录。双荧光素酶实验证明Ago2/endo-siRNA复合物能够以miRNA机制类似的非完全互补方式与抑制靶基因mRNA的翻译，且在减数分裂成熟过程具有重要功能的基因Calm1、Bub3、Nuf2和Chk1，都是Ago2/endo-siRNA复合物的靶基因。蛋白质组学分析证实了嵌合蛋白的存在，这也进一步证明了Ago2/endo-siRNA复合物介导的翻译调节广泛存在于小鼠卵母细胞中。

双荧光素酶实验中，核苷酸突变导致荧光素酶活性更高（图片引自文献[1]）

该研究开发了LACE-seq技术，能再微量细胞或单个卵母细胞中，在单核苷酸水平精确的定位Ago2和多个RBP的结合位点，并使用这种技术对卵母细胞中Ago2/endo-siRNA复合物的结合位点进行了分析。

参考文献：

Su Ruibao,Fan Li-Hua,Cao Changchang et al. Global profiling of RNA-binding protein target sites by LACE-seq.[J] .Nat Cell Biol, 2021, 23: 664-675.