新版细胞毒性检查法——琼脂扩散法

细胞毒性是化学物质（药物）作用于细胞基本结构和/或生理过程，如细胞膜或细胞骨架结构，细胞的新陈代谢过程，细胞组分或产物的合成、降解或释放，离子调控及细胞分裂等过程，导致细胞存活、增殖和/或功能的紊乱，所引发的不良反应。

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供试品制备将样品用纯化水冲洗干净（根据实际情况需要），用滤纸吸干。

若用供试品液进行试验，将制备的供试品液附着到生物多性吸收性的基质（例如超细硼硅玻璃纤维滤纸）上，支撑面积不少于100个单位的圆形供试品。

阴性对照制备取生物毒性参比物质，例如：高密度聚乙烯。按照供试品制备项下的规定进行。

阳性对照制备 取生物毒性阳性参比物质，例如含二乙基二硫代氨基甲酸锌的聚氨酯（ZDEC）。按照供试品之辈项下的规定进行。可采用10%二甲基亚砜（DMSO）溶液，附着到生物惰性吸收性的基质上。

检查法

取细胞悬浮液（1X105个/ml）7ml，均匀分散至直径60mm的培养皿中。置于含（5±1）%CO2气体的西跑培养箱中培养24h至汇合单层细泡，弃去培养皿中培养基，将融化琼脂冷却至48度左右与含20%血清的2倍新鲜哺乳动物细胞培养基混合，使琼脂最终质量浓度不大于2%，在每只培养皿内加入新制备的含琼脂培养基（要足够博以利于可沥滤物的扩散）。

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含琼脂培养基凝固后，可适当的的染色方法染色，将供试品、阴性对照、阴性对照小心地放在培养皿的固化琼脂层表面。

每个供试品、阴性对照、。阳性对照试样间尽量保持合适的距离并远离培养皿壁，每一培养皿中放置不超过3个试样，每个试样至少设置2个平行，置（37±1）度含（5±1）%CO2的细胞培养箱中至少培养（24±2）h。培养箱宜保持适当的温度。用显微镜观察每个供试品、阴性对照、阳性对照试样反应区域。用活体染料如中性红可有助于检测细胞毒性。

结果评价 进行细泡毒性评价和分级，对照下表阴性对照为0级（无毒）、阳性对照不小于3级（中度毒），则细胞培养试验系统有效。检测提取液时，供试品液的反应区域应减去介质对照的反应区域，再进行毒性分级。供试品和或供试品液细胞毒性大于2级（轻度毒）以上时，则判为合格。