测序常见问题

1. 为什么无法直接测得基因组全长？

• 提取过程中基因就已经断了。
• 使用PCR，限制了长度。

2. 各个/代 测序平台或技术有何区别？

   
   

3. GC 偏向对测序结果有何影响？
   GC% 正常值为30%～65%。

GC 会影响PCR。主要体现以下方面：

• GC 氢键多，难以解链。过多会使模版链解链不完全。
• GC 易自身互补配对形成发夹，影响扩增。
  （通过pcr-free 来减少GC 影响）

4. 如何选择读长与插入片段大小？

• 文库大小要与reads 读长相协调。
• denovo 拼接，先使用小片段文库，再逐渐使用大文库。
• RNAseq 测序片段过短，文库不能太大。
  （原则当然是稳定性保证下，读长越长越好）

5. 为什么不能一直测序下去？
   理论上来说，是可以测通一条序列的。
   但这样会显著增加错误，甚至质量低到不能使用，主要由酶活性降低造成。

   
   

实际测序中，读取测序信号过程会有差异，总有一些碱基读取的快或慢。pre-phasing与phasing。
而如果一次测通一条序列，则可能会因为这些结果引起的信号差异而造成读取错误。

6. 有哪些类型的测序（样品）？

   
   

7. 测序注意要点。

• 保证DNA 质量，不能降解。
• 样品量要满足建库要求。
• 根据样品和测序目的选择合适的建库策略。
• 测序要饱和。