本文主要是解决sgRNA体外切割活性效率的评估及图形化展示。
软件：
- Gel-Pro Analyzer
- ImageJ
一、Gel-Pro Analyzer分析
启动Gel-Pro Analyzer，依次选择："文件" > "打开" > "目标文件"
工具栏选择 "1D-凝胶分析" > "显示凝胶分析工具"
1.1. 在弹出的工具栏中，"选择" >"泳道识别" > "添加泳道"
1D-凝胶分析
如果泳道宽度不能很好匹配条带的宽，可以手动设置条带的宽度（尝试几次）。
image.png
泳道选择后如下：
图片.png
此时匹配的泳道过长，需手动调整到合适的范围；
image.png
1.2. 带识别
添加泳道的同时，软件会自动识别条带，而识别往往并不精确，需要手动设置，。
选择 "带识别" > "删除带"
单击泳道将识别带一一删除（红色短线表示主带的位置）；
image.png
然后，选择 "增加带"，依次在目的条带位置单击；结果如下：
image.png
图中的蓝色框指代的是主条带的范围，有时候不同蓝框之间重叠，可以点击图片方框进行范围调整。但是如果重叠严重则手动调整十分不方便，解决办法：
当单击增加带后会出现曲线图，或者单击 "1D-凝胶分析" > "显示曲线"，弹出曲线图，然后在曲线上面单击鼠标选择范围，更为便捷。
image.png
图中的1就是增加带的主带位置，2/3分别是蓝框的左右边界线。
调整后的图形，蓝色线框应该互补重叠，互不干扰。
image.png
1.3. 数据导出：
"泳道曲线" > "文件" > "图形拷贝到剪切板"（导出灰度图片）
"文件" > "打印图形" ， 以PDF文件存储（注意调整图片的方向和长宽比例）
image.png
点击 "结果"，将给出灰度的结果
image.png
可以选择 "文件" > “”数据拷贝到EXCEL " 保存。胶图可以通过截屏截取，最终呈现的效果如下：
image.png
二、切割效率计算
如果按照上面给出的数据，显然计算起来不是很准确。这时候需要用到ImageJ
2.1. "file" > "Open" > picture
选择"矩形选框"
图片.png
2.2. 框选图中条带，"Analyze" > "Gels" > "Set the First Lane"(快捷键Ctrl + 1)
移动选框至第二个区域(小手指是更改选框大小，箭头是移动选框)
"Analyze" > "Gels" > "Set the Second Lane" (快捷键Ctrl + 2)
如果是最后一个，则选择"Ctrl + 3"，会自动弹出所选区域图形的峰图
图片.png
图片.png
2.3 然后放大图形会看到局部并不是闭合状态的，所以需要用直线工具添加直线，使其闭合。然后直线工具，以一端为顶点做直线封闭峰图。
图片.png
图片.png
2.4. 选择魔术棒工具，点击封闭的区域，直接弹出对应的值，据此可以计算相对含量的多少。
图片.png
TIP：一定要在选择一个空白的区域做背景校正！
2.5. 计算公式：
CodeCogsEqn.png
图片.png
为什么是这个公式，仔细思考？不明白可以私信我释疑。
延伸：
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ImageJ条带分析中图形的含义：
A: 方框选择在条带的中间区域：
图片.png
B: 方框选择在条带的上方区域：
图片.png
可以看出来，图形曲线的规则是，在选定的方框区域，从上方到下方的条带灰度曲线。
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