Pull-down蛋白质鉴定流程

Pull-down实验是一种有效的验证蛋白之间相互作用的体外实验技术，常用来验证酵母双杂交系统或者其他方法筛选到的互作蛋白。Pull-down实验基本原理是将靶蛋白亲和固定在基质上，充当“诱饵蛋白”，当细胞抽提液或者其他含有目的蛋白溶液过柱时，与靶蛋白相互作用的目标蛋白可以结合到基质上，其他非互作的杂质蛋白则随溶液流出。通过洗脱液或者洗脱条件可以将吸附的互作蛋白洗脱下来，使用Western Blot或者质谱进行检测。该方法简单易行，操作方便，不需要用到危险的同位素等物质，在蛋白质相互作用分析方面已得到广泛的应用。

Pull-down蛋白质鉴定的步骤为：体外表达纯化”诱饵蛋白”（通常使用GST、polyHis和靶蛋白的融合蛋白或者生物素标记的靶蛋白）；使用固定化亲和配体将诱饵蛋白与固相基质稳定结合；再将诱饵蛋白与待测细胞裂解液或者其他含有目标蛋白的溶液进行孵育，在这一过程中，诱饵蛋白与目标蛋白相互作用并结合在一起，通过清洗除去非特异性结合的杂蛋白，即可获得与诱饵蛋白相互作用的目标蛋白；最后通过LC-MSMS高分辨率质谱对目标蛋白进行鉴定。

Pull-down蛋白质鉴定流程（图片来源：百泰派克生物科技）

Pull-down蛋白质鉴定具体流程：

1、构建带标签的诱饵蛋白原核表达载体；

2、载体转化大肠杆菌，表达诱饵蛋白（这一步比较关键，很多蛋白原核表达会形成包涵体，极大影响后续实验，我们采用自诱导培养基培养细菌，使得包涵体形成的几率大大降低）；

3、裂解细菌，裂解液过柱子（特异结合his或GST标签）；

4、待测样品裂解，裂解液过柱子，互作蛋白被吸附在柱子；

5、清洗，离心，去除未结合的杂蛋白；

6、洗脱，得到诱饵蛋白及其互作蛋白的复合物；

7、下一步根据实验目的可以去做western blot 或质谱

①如果验证某个蛋白X与诱饵蛋白互作，则拿上一步的蛋白复合物去孵育X抗体，做western blot；

②如果寻找诱饵蛋白的所存在的可能的互作蛋白，则拿上一步的蛋白复合物去做LC-MS/MS，对照组、实验组的复合物分别做LC-MS/MS。

百泰派克生物科技利用进口的GST pull-down试剂盒，能够快速准确的完成蛋白互作实验，结合公司先进的UPLC-MS质谱平台，推出基于Pull-down蛋白质鉴定分析一站式技术服务，灵敏度高、分辨率准确。我们既可以对pull-down实验后的蛋白样品进行检测，也可以根据客户寄来的样品，提供从pull-down实验到样品质谱分析的一站式解决方案。

资料来源：百泰派克生物科技、百度文库分享