文章概览
题目：Developmental and oncogenic programs in H3K27M gliomas dissected by single-cell RNA-seq
中文题目：使用单细胞RNA测序分析H3K27M胶质瘤的发育和致癌性
第一作者：Mariella G. Filbin, Itay Tirosh, Volker Hovestadt
通讯作者：Aviv Regev, Bradley E. Bernstein, Mario L. Suvà
日期：2018.4.20
被引次数：254
期刊：Science
影响因子：41.845
样本信息
样本信息1
样本信息2
作者从六个H3K27M胶质瘤（表1）的诊断活组织检查中获得了新鲜组织。每个样品分离成单个细胞，经过流式细胞分选，得到3321个细胞，使用smart-seq2的全长scRNA-Seq测序。保留了 2458个通过质量控制的细胞用于下游分析，其中鉴定的恶性细胞有2259个（表2）。
H3K27M胶质瘤细胞的特征
细胞的特征主要按起源肿瘤分组（图 1A），有两个簇包含来自多个肿瘤的细胞，通过表达的marker基因来看分别是小胶质细胞和OC。并使用WGS和WES对基因突变和拷贝数变异情况进行了定量。
图1 细胞概览
接下来，作者还比较了H3K27M glioma和IDH-A, IDH-O, GBM中的恶性细胞及其差异基因。（图2）
图2 不同肿瘤恶性细胞的比较
H3K27M glioma中的许多基因上调，但很少有下调，H3K27M上调的基因富集了PRC2的靶基因，这与 PRC2 对 H3K27M 的阻断抑制一致。PRC1 亚基BMI1在 H3K27M 胶质瘤中上调，可能代表了对 PRC2 抑制的补偿机制。与对照组相比，敲除BMI1降低了H3K27M胶质瘤细胞的活力
H3K27M抑制PRC2（polycomb repressive complex 2），引起染色质H3二甲基化（K27me2）和三甲基化（K27me3）整体减少，这种H3K27甲基化整体缺失导致细胞增殖潜能增加和分化能力下降。
H3K27M 胶质瘤恶性细胞的亚群确定
接下来，作者确定了 H3K27M 胶质瘤恶性细胞的不同亚群。作者确定了四个程序P1 到 P4，它们在不同肿瘤内表现一致，分别为：细胞周期（例如PCNA和CDK1）、AC-like（例如GFAP和APOE）、OC-like（如MBP和PLP1），以及OPC-like（如PDGFRA和CSPG4）（图3A, B）。对这些表达程序的每个细胞进行评分突出了一个假定的发育层次（图3C），其中增殖主要在于 OPC-like细胞，这些细胞可能会自我更新并产生OC-like和AC-like细胞。通过RNA原位杂交可以验证这样的细胞组成。（图3D）
图3 恶性细胞的分类
每个肿瘤内部的细胞比例各有不同，但 OPC-like细胞始终是占比最多的细胞类型（图4 top）。图4 bottom为cycling细胞的比例。
图4 各样本中的细胞比例
对正常脑细胞类型的分析表明，PRC2 靶基因由 OPCs 高表达而由 OCs 低表达。因此，OPC向OC的分化可能需要PRC2的抑制作用，但H3K27M突变导致PRC2失活，这可能导致自我更新的OPC样细胞的积聚。因此，一些肿瘤几乎没有谱系分化的证据（图4）。此外，通过使用 CRISPR/Cas9敲除 OPC 的谱系因子PDGFRA降低了两种 H3K27M 胶质瘤模型的生存能力。综上，OPC-like细胞是 H3K27M 肿瘤的主要亚群。
Identification of intra-tumor variability programs using NNMF：作者在这里使用NNMF(Non-Negative Matrix Factorization, 非负矩阵分解)来解析恶性细胞的亚群。首先对于六个样本的表达矩阵进行中心化，再将负值变为0后，执行NNMF，将输出结果设置为10个factors（可以理解为10个表达程序），然后挑出每个factor的前30个NNMF分值最高的基因作为每个表达程序的signature基因。整合每个样本的10个signature基因集，总共得到60个基因集。然后利用基因集的打分算法对每个细胞进行这60个基因集的打分。然后将60个NNMF programs进行层次聚类，发现有三个programs的集合（P1，P2和P3）分别对应着细胞周期和两个分化过程。（图M1）对于这三个program集合中的每一个执行以下操作：对每个基因依据他们在某个集合中的平均分排序，再取前30个作为新的基因集。最后利用新的三个基因集对这些细胞进行打分。
对于剩下不属于任何一个meta-program的细胞，作者将他们与前三个亚群的细胞进行了差异表达，发现在第四个亚群中，没有任何一个基因比剩下的三个亚群都显著高表达，而有20个基因在第四个亚群中比三个中的两个亚群显著高表达，在这20个基因中，有19个是第四个亚群比AC-like和OC-like要显著高表达的基因，然而他们不在cycling亚群中显著高表达。这19个基因构成的基因集合被定义为P4，并且这些基因显著表达OPC程序，因此被定义为OPC-like program。
图M1 利用NNMF对肿瘤细胞分群
Definition of single-cell gene signature scores：类似于IDH-O那篇文章的细胞打分规则，Seurat中的AddModuleScore()函数可以实现此功能。
IDH-A, IDH-O,H3K27M三种胶质瘤的比较
H3K27M胶质瘤和IDH 突变胶质瘤的组成类似，但在细胞比例和每个亚群的特征基因上有所不同。对于AC-like的特征基因，三种胶质瘤高度相似（图5A），而OC-like和stem-like的基因在三者之间有很大不同（图5C, E）。事实上，H3K27M 的特异性干细胞基因被 OPC高表达（如PDGFRA），而IDH特异性干细胞的基因被NPC高表达（如表达SOX11）（图5F），而且H3K27M 胶质瘤比 IDH 突变胶质瘤具有更多的cycling和未分化细胞（图5H），这可能是它们更具攻击性行为的原因。
图5 三种胶质瘤的比较
CNV分析
此外，CNV 分析和单倍型推断揭示了两种肿瘤中不同的遗传亚克隆（图6I, J）。BCH869 中的所有细胞都丢失了 14 号染色体的一个副本，但亚克隆具有不同的单倍型，表明两个不同的事件导致了 14 号染色体等位基因的丢失（图6J）。此外，某些体细胞基因突变可以只存在于其中一个亚克隆（图6K）。使用 CNV 和单倍型频率可以推断系统发育树（图6L），每个遗传亚克隆都包含相似的细胞类型，尽管它们的相对比例有所不同（图6M），这表明不同的遗传亚克隆在 H3K27M 神经胶质瘤中具有相似的发育层次。
图6 CNV分析
最后，作者比较了来自患者来源的异种移植物（PDX）、胶质瘤球（GS）和分化的胶质瘤细胞（DGC）与病人的表达差异，突出了这些体外模型的局限性。
最后，作者提出了与正常发育（图7左）相比的 H3K27M胶质瘤细胞结构模型（图7右）。
图7 H3K27M胶质瘤的肿瘤模型
本文提到的marker基因
Microglia: CD14, CX3CR1, AIF1
OC: MBP, PLP1
Cycling: PCNA, CDK1,
AC-like: GFAP, APOE
OC-like: MBP, PLP1
OPC-like: PDGFRA, CSPG4
NPC: SOX11
参考
https://science.sciencemag.org/content/360/6386/331
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