大家好，这次分享近期发在《Nature》上的一篇长文，"Hydrogen peroxide sensor HPCA1 is an LRR receptor kinase in Arabidopsis"找到了多年未找到的过氧化氢受体。这项工作是在前期的钙离子成像的筛选体系的基础上，鉴定得到的另一种重要的小分子受体。之前他们已经用这套体系得到了盐受体相关文章请看:Plant cell-surface GIPC sphingolipids sense salt to trigger Ca******2+ influx.
Abstract
过氧化氢在单细胞和多细胞生物中是一种主要的活性氧形式，且在胞外产生。过氧化氢通过水通道蛋白进入细胞，以共价形式修改胞质蛋白来调节信号和细胞过程。然而，质膜上是否存在过氧化氢的受体现在还不知道。在植物细胞，过氧化氢激发钙离子内流，这被认为涉及到过氧化氢的感知和信号转导。我们基于钙离子成像技术进行正向筛选，在拟南芥中鉴定到hydrogen-peroxide-induced Ca increases(hpca)突变体，鉴定到HPCA1作为一个LRR受体激酶，胞外有两对半胱氨酸残基，之前并未报道属于任一家族。HPCA1定位在质膜，并且经由过氧化氢激活胞外半胱氨酸残基的共价修饰，导致了HPCA1的自磷酸化。HPCA1诱导了保卫细胞钙离子通道的激活，介导了气孔关闭。
Results
Mutants defective in eH2O2-induced Ca2+ increases
eH2O2(extracellular H2O2)
首先基于钙离子成像体系筛选突变体(依据是过氧化氢处理后，胞内钙离子没法增加)，得到突变体后进行全基因组测序，拿到基因hpca1。hpca1的种子没有表现出明显的形态学和发育上的表型，但是与WT相比，面对H2O2的处理，表现出更低的钙离子增加(F1a,b)。并且钙离子的峰值也更低(F1c-e)。在施加不同浓度的H2O2处理时，突变体展示出更低的敏感性，但对山梨糖和NaCl却没有变化(F1f-h)。
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Impaired guard cell eH2O2 Ca2+ signalling in hpca1
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鉴于对H2O2的响应这么明显，我们就想是否hpca1影响了已知的H2O2通路。我们观察到在突变体的保卫细胞中展示出更低的H2O2介导的钙离子通路和更多张开的气孔(F2a-d)。使用膜片钳技术，我们在WT保卫细胞原生质体中，得到了较强的H2O2激活的钙离子信号，而不是在hpca1中(F2e-g)。即使使用ABA处理，也不能让突变体的气孔关闭(F2h)，且离体的突变体叶片更容易丢失水分。这些结果表明，hpca1在eH2O2诱导的保卫细胞Ca2+和ABA信号通路中表现出明显的缺陷，并表明hpca1在感知eH2O2方面存在关键缺陷。
HPCA1 encodes an LRR receptor kinase
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对群体的图位克隆和全基因组测序得到，基因突变的三个SNP位点，并且具有相似的表型(F3a,b)。HPCA1属于LRR-RLK家族的第八亚家族，为了确定是HPCA1造成的表型，我们做了自身启动子驱动的回补突变体，发现表型能恢复(F3bc)。对表达模式进行探索发现，HPCA1在整个部位都表达，特别是在子叶和保卫细胞(F3de)。转基因植物根尖荧光和烟草亚细胞定位显示HPCA1定位于质膜(F3f)。早先有报道flg22和elf26也能引起胞内钙离子增加，分别处理hpca1发现并没有对其钙离子的增加有影响,并且用H2O2处理fls2和efr也不影响其对钙离子的增加(FS8)。早先有人报道ghr1突变体表现出对H2O2较强的响应，我们比较了hpca1和ghr1,发现在ghr1中H2O2诱导的钙离子增加并不受影响，暗示HPCA1可能作为GHR1的上游。
eH2O2 activates HPCA1 kinase
我们接下来想探究，是否HPCA1的激酶活性对它发挥功能很重要。我们使用了广谱的蛋白激酶抑制剂K252a，发现施用K252a后，减弱了保卫细胞内H2O2诱导的胞内钙离子浓度增加和H2O2诱导的钙离子电流增加，还破坏了H2O2诱导的气孔关闭(F3,hi)。在回补突变体中施用H2O2，使得HPCA1的发生磷酸化(Thr)，且随浓度的增加而增加(F3j)。体外蛋白纯化试验说明，HPCA1的胞内域会发生自磷酸化，而把激酶活性失活、催化活性失活和截短后都不能检测到激酶活性(F3gk)。在施用蛋白磷酸酶后，体内就不能检测到磷酸化的条带，这也就确定了HPCA1自发磷酸化的活性。将这三种突变形式去回补突变体，发现也不能回补突变体的表型(F3I)。综上，这些结果说明，H2O2激活了HPCA1的激酶活性，导致了HPCA1的自发磷酸化和下游的H2O2诱导的事件。
H2O2 oxidizes HPCA1 extracellular Cys residues
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H2O2介导的半胱氨酸氧化为亚磺酸和二硫键，标志着氧化信号转化为动态生物反应。我们想知道胞外H2O2结构域上的半胱氨酸能否被H2O2所修饰。膜不渗透生物素化硫醇修饰试剂，碘乙酰胺-生物素(IA-biotin，使蛋白质保持还原状态)和MTSEA-生物素(图示星号部分表示，这种二硫键很容易被相邻的Cys残基还原，在Cys残基之间形成二硫键)，用于处理保卫细胞原生质体。结果显示，不管有或没有的H2O2处理，MTSEA-biotin而不是IA-biotin处理，能在WT中记录到电流，而在hpca1中没有。这些研究说明，钙离子电流的激活在二硫键形成后发生，揭示胞外的半胱氨酸残基也许是H2O2感知的位点。将重要的半胱氨酸残基突变后，不能互补突变体的表型(F4ef),说明该半胱氨酸残基对H2O2的感知很重要，但仍然定位在膜上。
为了探明胞外的半胱氨酸是否以还原形式存在，并且在植物体内能够被H2O2所氧化，我们使用IA-biotin来标记胞外还原的半胱氨酸。我们注射IA-biotin到表达HPCA1-YFP和半胱氨酸突变HPCA1-YFP的回补突变体中，提取HPCA1-YFP蛋白，用biotin抗体鉴定还原性的半胱氨酸。我们发现，在HPCA1-YFP回补突变体中发现了较多还原性的半胱氨酸，而在点突回补突变体中却没有，而且还原性的半胱氨酸随着H2O2的浓度增加而减少，这也就暗示，胞外半胱氨酸残基存在还原形式并且在体内能够被氧化。
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为了确定是胞外的半胱氨酸被氧化了，我们分别用IA和NEM来标记还原的半胱氨酸和氧化的半胱氨酸，并且用质谱来分析，结果发现在h202处理后，氧化型的半胱氨酸增加了将近10%(F4h-j)。综上揭示了HPCA1胞外的半胱氨酸被H2O2共价修饰来激活HPCA1激酶活性并且打开钙离子内流通道(F4k)。
启示：
1.一套好的筛选体系是多么地重要。
2.并没有直接的binding试验，刷新了我对之前证明受体的认识。下游的信号转导是必不可少，而上游的结合，可以用多个证据无限说明ligand对受体产生了影响。且保证自己的gene在已报到的相似基因的上游，如HPCA1在GHR1上游。
3.文章思路清晰但技术操作难度较大，必要的遗传手段不可少，但真正做出新意要靠更先进的技术。
4.要用多个数据来说明一个问题，显得观点充分。
原文链接：
盐受体:www.nature.com/articles/s41586-019-1449-z
过氧化氢受体:https://doi.org/10.1038/s41586-020-2032-3
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