这次分享的是遗传所周俭民老师在2018年发表在《The Plant Cell》上的paper，"Receptor-Like Cytoplasmic Kinases Directly Link Diverse
Pattern Recognition Receptors to the Activation of Mitogen-
Activated Protein Kinase Cascades in Arabidopsis"。周俭民老师是国内做植物免疫的标杆性人物，希望能从他们的试验设计上学到些东西。
Abstract
植物部署大量的细胞表面的模式识别受体(PRRs)来感知宿主和微生物产生的分子模式，这些模式是在感染过程中特别释放的，并激活防御反应。有丝分裂原活化蛋白激酶MPK3、MPK4和MPK6 (MPK3/4/6)的激活是所有已知PRRs激活免疫系统的一个标志，对建立抗病性至关重要。MAPKKK中的MEKK1控制MPK4的激活，但是在不同PRRs下游中负责MPK3/6激活的MAPKKKs，以及对不同分子模式的识别是如何导致MAPKKKs激活的，仍然是一个谜。在这里，我们展示了两个高度相关的MAPKKKs MAPKKK3和MAPKKK5，通过至少4个PRRs来介导MPK3/6的激活，并赋予拟南芥对细菌和真菌的抗性。RLCK VII家族，在PRRs的下游发挥作用，直接磷酸化MAPKKK5的第599位Ser，然后导致了MPK3/6的激活、防卫基因的表达和抗病性的产生。有意思的是，MPK6进一步磷酸化MAPKKK5 682位 Ser和692位的Ser来增强MPK3/6的激活与抗病性，显示了一个正反馈机制。最后，MEKK1 603位的Ser被RLCK VII和MPK4磷酸化，这是触发的MPK4激活所必需的。这些发现阐明了多种PRRs激活MAPK级联和抗病的中心机制。
Introduction
PRR作为植物免疫检测系统的第一道防线，早被人所知的有FLS2(FLAGELLIN SENSITIVE2)、EFR(EF-TU RECEPTOR)、LYK5(LYSIN MOTIF RECEPTOR KINASE5)、PEPRs(PLANT ELICITOR PEPTIDE RECEPTORs)。感知到相应ligand后，FLS2、EFR、PEPRs与它们的共受体BAK1(BRASSINOSTEROID INSENSITIVE1-ASSOCIATED KINASE1)形成异源二聚体。感知到chitin后，LYK5与其共受体CERK1形成复合物。数分钟后，PRRs激活下游一系列的防卫反应，包括钙离子从质外体的瞬时流入、钙依赖性蛋白激酶的激活、胞外ROS的产生和MAPKs的激活。
PRR或共受体的下游被认为是第七类RLCK家族来传递信号。BIK1(BOTRYTIS-INDUCED KINASE1)整合了来自多个PRRs的信号，包括FLS2, EFR, PEPRs, and LYK5。感知到信号后，BIK1直接磷酸化NADPH氧化酶 RBOHD来产生初级的ROS。
迄今为止研究的所有PRR都激活了两个MAPK级联。一类级联由MAPKKK -MEKK1、MAPKK-MKK1和MKK2以及MPK4组成(也就是从3K到2K再到1K)；另一类级联由两个MKKs, (MKK4和MKK5)，两个MAPKs,(MPK3和MPK6)组成。后面这一级联反应在植物免疫中有更重要的作用，能够激活基因表达、植物抗毒素和乙烯的合成及气孔免疫。矛盾的是，控制各种PRR下游第二类MAPK级联的MAPK的MAPKKKs仍然难以捉摸。而不同PRRs认为集中在同一MAPKKKs 来进行MAPK激活,最近的一份报告表明,MAPKKK5和PBL27(RLCK VII类家族成员),正调节chitin介导的 MPK3/6激活但负调控flg22介导的 MAPK激活【有意思的是，本文作者并没有得出该结论，也没有对人进行debate，说这是试验条件不同导致的】。
Results
MAPKKK3/5 Are Phosphorylated in Response to Multiple Patterns
通过分析拟南芥的基因表达数据库得到接病后受诱导最高的3k激酶-MAPKKK5。构载体，如图1A。Lys375Met破坏了MAPKKK5自身磷酸化，便于查看其上游对其进行磷酸化的激酶。在原生质体中表达载体，并用flg22处理。全长的MAPKKK5和MAPKKK5K375M显示有磷酸化现象，且不依赖flg22处理【作者对这里的解释是：大的磷酸化的蛋白在phospho -tag分析中分辨率较差，结果不太可信 】；并且C-MAPKKK5不管有无flg22都能自发磷酸化，而C-MAPKKK5K375M展示出被flg22激发的磷酸化【这里我觉得他扯淡，可能b图最后一个的第一条泳道有两条带的原因是被其他激酶加了磷酸基团，即使没有被处理】；N端的磷酸化显示磷酸化不依赖于flg22处理(图1B)。flg22，chitin，elf18和pep2都能诱导C-MAPKKK5K375M和C-MAPKKK5K243M条带迁移，揭示MAPKKK5可能被各种PRRs激活(图1CD)。【条带大小不一可能由于加的磷酸基团的数量不一样，不用全长做是因为在phos-tag里面全长的迁移不受flg22的影响，不知道他这里的K243M是哪里得到的，通篇没有介绍】
Figure 1. Patterns Trigger MAPKKK35 Phosphorylation-1.png
MAPKKK3/5 Are Required for MPK3/6 Activation Triggered by Multiple Patterns
Figure 2. MAPKKK3 and MAPKKK5 Regulate Pattern-Induced MAPK Activation-1.png
Figure 2. MAPKKK3 and MAPKKK5 Regulate Pattern-Induced MAPK Activation-2.png
与野生型(Col-0)幼苗相比，mapkkk5突变体中由flg22触发的MPK3/6活性略有降低，而由chitin、elf18和pep2触发的MPK3/6活性则完全正常(图2A和图2B)。不管使用哪种elicitor，在mapkkk3突变体中MPK3/6的激活不受影响。因为MAPKKK3和5是高度同源的，在双突(mapkkk3 mapkkk5)中我们发现，与Col-0相比，flg22诱导的MPK3/6的激活减少了大约55%，而chitin、elf18、pep2诱导的MPK3/6的激活减少了80%-90%(F2F-2I)【也就是单突差异不大的时候做多突】。这些结果揭示了在面对各种elicitor的时候，需要MAPKKK3/5来诱导MPK3/6的激活。在我们测试的这些PRRs中，包括FLS2、EFR、CERK1、PEPRs，都通过MAPKKK3/5来激活MPK3/6。
MAPKKK3/5 Are Required for Pattern-Triggered Defense Gene Expression and Disease Resistance
Figure 3. MAPKKK35 Are Required for Defense Gene Expression and Disease Resistance-1.png
Figure 3. MAPKKK35 Are Required for Defense Gene Expression and Disease Resistance-2.png
早先有人报道，MAPK信号可以调节FRK1(FLG22-INDUCED RECEPTOR KINASE1)的转录水平。在双突(mapkkk3 mapkkk5)中,在用不同的elcitors处理时，如flg22，chitin，elf18，pep2，与WT相比，转录水平下降了27-70%，并且具有显著差异，ligand各自受体做阳性对照(F3A)。并且对双突接病后发现3-4倍的细菌生长和2倍多的真菌病斑长(F3B、3C)，这些结果也与图2F-2I的MAPK的激活减少联系起来【尽管我觉得这里的时间对应不上，一个是10min，一个是3d】，揭示了需要MAPKKK3/5来实现对细菌和真菌的抗性。
RLCK VII-4 Subfamily Members Link PRRs to MAPKKK5
Figure 4. RLCK VII Subfamily Members Link PRRs to MAPKKK5-1.png
Figure 4. RLCK VII Subfamily Members Link PRRs to MAPKKK5-2.png
RLCK VII这个家族包含46个成员，在PTI中发挥重要作用，然而单敲BIK1或家族的其他成员对于MAPK的激活却没有影响。早先有人报道AvrAC是一种专门针对多个RLCK VII亚家族成员的尿苷基转移酶，它可以阻止flg22触发的MAPK激活。接下来我们想知道，MAPKKK5的磷酸化是否由RLCK VII家族的成员来完成。在原生质体中表达AvrAC-flag抑制了flg22激发的C-MAPKKK5K375M的磷酸化(F4A)，揭示了特定的RLCK VII成员主导了elicitor介导的MAPKKK5的磷酸化。接下来我们想通过双荧光素酶互补试验来筛选与MAPKKK5互作的蛋白，因为MAPKKK5能诱发烟草的细胞死亡，因此我们使用kinase-dead 突变体MAPKKK5K375M来完成。MAPKKK5K375M与某些的RLCK VII成员互作，但是不包括BAK1，因此MAPKKK5与RLCK VII的大多数成员都互作(F4B)。
接下来用了rlck vii-4六突，结果发现在原生质体中chitin激发的C-MAPKKK5K375M磷酸化减少了25%，而flg22激发的C-MAPKKK5K375M磷酸化并未受影响，因此RLCk VII-4特定的介导了chitin激发的MAPKKK5的磷酸化。在pbl27突变体中，C-MAPKKK5K375M仍被磷酸化(F4C)，因此说明是RLCk VII-4，而不是PBL27，参与了chitin激发的MAPKKK5的磷酸化和MAPK的激活。
接下来通过LC-MS鉴定MAPKKK5磷酸化位点，C端有三个，Ser-599, Ser-682, and Ser-692，其中Ser-599在其他物种和MAPKKK3中也是保守的。然后开始在双突中(mapkkk3/5)做转基因的回补材料(都是native promoter驱动)，empty vector(EV)，MAPKKK5-HA，phospho-dead MAPKKK5S599A，MAPKKK5s682/692A(2A)，模拟磷酸化MAPKKK5S599D(S599D)、MAPKKK5s682/692E(2E)。
为了查明MAPKKK5的磷酸化是否发生在这三个位点，我们制作了分别识别这三个位置磷酸化的抗体。在没有被诱导的样本中没有检查到信号，在chitin处理的样本中在这三个位点检查到较强的信号，在MAPKKK5S599A和MAPKKK5s682/692A(2A)却没有检查到(F4DE)。这些结果说明，chitin激发MAPKKK5这三个位点的磷酸化。PBL19作为RLCk VII-4的一个成员，我们想测试一下是否PBL19能磷酸化MAPKKK5，结果发现，只有CERK1和PBL19同时存在时，MAPKKK5才被磷酸化(F4F)。
Phosphorylation of MAPKKK5 at Ser-599 Is Required for MAPK Activation and Disease Resistance
Figure 5. Phosphorylation of MAPKKK5 at Ser-599 Is Required for MPK36 Activation and Disease Resistance-1.png
Figure 5. Phosphorylation of MAPKKK5 at Ser-599 Is Required for MPK36 Activation and Disease Resistance-2.png
我们在mapkkk3 mapkkk5双突的回补材料(EV,MAPKKK5,MAPKKK5S599A,MAPKKK5S599D)中用chitin处理来看Ser-599位置的磷酸化对激活MPKs的作用。MAPKKK5,MAPKKK5S599D的回补突变体材料展示出3.5倍左右的MPK3/6的激活，也就是只回补MAPKKK5能恢复双突表型(F5A)。【这里奇怪的是，双突中用单基因回补，几乎回复表型，但是在单基因突变体中差异却不是很大】而MAPKKK5S599A在面对chitin的反应与EV类似，揭示Ser-599的磷酸化对MAPKKK5的激活很重要。MAPKKK5S599D在没有chitin存在时不会有MPK3/6的激活，提示激活MAPKKK5需要Ser-599的磷酸化，仅599位的磷酸化还不足以激活MPK3/6。总之，这些结果说明RLCk VII-4家族的成员能够直接磷酸化Ser-599来正调节chitin激发的MAPKKK5的激活。接下来换做flg22处理，发现，MAPKKK5S599A在面对flg22的反应与EV类似，MAPKKK5与MAPKKK5S599D的反应类似(F5B)。上述结果说明，在flg22激发的MPK3/6的激活中，Ser-599的磷酸化也很重要。并且暗示其他的RLCk VII成员也通过磷酸化Ser-599来调节flg22激发的MAPKKK5的激活。
接下来，就想看一下flg22和chitin处理对FRK1转录水平的影响。MAPKKK5和MAPKKK5S599D展示出最高的FRK1的转录水平(F5CD)。并且不管接细菌病害丁香假单胞菌还是真菌病害灰葡萄菌都显示出类似的结果(F5EF)。因此说明MAPKKK5 Ser-599的磷酸化对抗病性的产生很重要。
MPK6 Phosphorylates MPKKK5 at Ser-682/692
Figure 6. MPK6 Phosphorylated MAPKKK5 at Ser-682 and Ser-692.png
预测得知，MPKKK5的Ser-682, and Ser-692位点是MAPK磷酸化的motif。体外磷酸化试验表明，GST-MAPKKK5-T与MPK6孵育在Ser-682, and Ser-692处有弱的磷酸化。加入MKK5的组成型激活形式-MKK5DD，导致了Ser-682, and Ser-692的强磷酸化，揭示MPK6能直接磷酸化Ser-682, and Ser-692这两个位点。过表达全长MAPKKK5可导致拟南芥原生质体细胞死亡，难以获得足够数量的MAPKKK5蛋白来进行磷酸化检测。因此，我们检测条件型mpk3 mpk6双突变体【mpk3 mpk6 PMPK6:MPK6YG (MPK6SR)】原生质体中的MAPKKK5-T磷酸化。该突变体被MPK6Y144G所恢复，扩展了ATP的结合口袋，对ATP激酶的抑制剂NA-PP1敏感。NA-PP1的加入特异性地抑制了MPK6SR原生质体中Ser-682和Ser-692的磷酸化(图6B)，支持了MPK6介导植物细胞中模式触发的Ser-682/692磷酸化的观点。在col-0中，不经chitin处理，我们检测到Ser-682的磷酸化而没有Ser-692的(F6C)，在rlck vii-4的突变体原生质体中，Ser-682磷酸化减少，Ser-692的磷酸化被破坏。这些结果表明，RLCK VII-4亚家族成员是植物细胞中由chitin触发的Ser-682/692磷酸化所必需的，这与在rlck vii-4中MPK6活化减少的观点是一致的。
Phosphorylation of MAPKKK5 at Ser-682/692 Enhances MPK3/6 Activation and Immunity
Figure 7. Phosphorylation of MAPKKK5 Ser-682692 Enhances MPK36 Activation and Immunity-1.png
Figure 7. Phosphorylation of MAPKKK5 Ser-682692 Enhances MPK36 Activation and Immunity-2.png
分别用chitin和flg22处理回补突变体的时候发现，与MAPKKK5相比，在经过chitin和flg22处理后，MAPKKK52A中MPK3/6激活程度略有下降，而MAPKKK52E中MPK3/6激活程度高于MAPKKK5(图7A和7B)，说明完全激活MAPKKK5需要Ser-682/692的磷酸化。 与Col-0相比，MAPKKK52E幼苗表现出更大的MPK3/6激活(图7C)，表明Ser-682/692磷酸化正调控对MPK3/6的激活。在mapkkk3 mapkkk5突变体的原生质体转MAPKKK52E，与转染MAPKKK5相比，显示出增强的chitin激发的MPK3/6的激活，瞬时表达MAPKKK5S599D，2E并没有进一步增强chitin引发的MPK3/6的激活，也没有导致MPK3/6的组成型激活(图7D)。
与完全恢复的MAPKKK5相比，MAPKKK52A细胞系部分恢复了FRK1的表达，而MAPKKK52E表现出更强的FRK1表达(图7E和图7F)，说明Ser-682/692 磷酸化正向调节flg22和chitin触发的免疫反应。接着接病处理，丁香假单胞菌和灰霉葡萄菌，呈现出与上述相同的结果(F7GH)说明，磷酸化的Ser-682/692能同时增强对细菌和真菌的抗性。【682/692的磷酸化是MPK6的作用，而599是RLCK的作用】
MEKK1 Is Phosphorylated by Both RLCK VII-4 and MPK4
Figure 8. Both RLCK VII-4 and MPK4 Phosphorylate MEKK1 at Ser-603-1.png
Figure 8. Both RLCK VII-4 and MPK4 Phosphorylate MEKK1 at Ser-603-2.png
接下来我们想看是否MEKK1也被相似的通路调控(PRR-RLCK VII-MAPKKK5)。使用summ2-8 mekk1突变体，因为SUMM2(一种NLR)监视MEKK1-MKK1/2-MPK4通路，当这条通路被破坏时，会激活免疫反应。
检测一个kinase-dead的C端MEKK1片段(C-MEKK1K361M-HA)【在ATP结合位点发生Lys361Met突变】，用flg22、elf18和chitin处理原生质体后，SDS-PAGE上出现了磷酸酶敏感性的迁移率变化(图8A)，表明MEKK1是由模式触发的磷酸化。LC-MS鉴定磷酸化位点，替换Ser-603(但不包括其他四个残基)到Ala导致了chitin-或flg22诱导的C-MEKK1K361M条带迁移消失(图8B)，说明Ser-603在模式触发的MEKK1磷酸化过程中是一个主要的磷酸化位点。对照样品中未检测到信号，但chitin处理样品中检测到MEKK1中Ser-603位点磷酸化的强信号(图8C)。这些结果证实了chitin确实能够触发MEKK1在Ser-603位点的磷酸化。上述磷酸化特异性抗体特异性检测到chitin触发C-MEKK1K361M的磷酸化，而不是C-MEKK1K361M/S603A(图8D)。
与summ2-8相比，在summ2-8 mpk4中，chitin和flg22诱导的的MEKK1磷酸化减少(图8f)。此外，从原生质体中纯化得到的MPK4- flag蛋白可使GST-MEKK-T重组蛋白在Ser-603位点磷酸化(图8G)，表明MPK4可直接磷酸化Ser-603位点的MEKK1。
Phosphorylation of MEKK1 at Ser-603 Is Required for MPK4 Activation and the Suppression of Autoimmunity
Figure 9. Phosphorylation of MEKK1 at Ser-603 Is Required for the Activation of MPK4 and the Suppression of Autoimmunity-1.png
Figure 9. Phosphorylation of MEKK1 at Ser-603 Is Required for the Activation of MPK4 and the Suppression of Autoimmunity-2.png
如图9A和9B所示，与野生型MEKK1转化的植株相比，在MEKK1S603A系中，flg22和chitin诱导的MPK4活化减少，说明MEKK1的活化需要Ser-603磷酸化。我们接着在mekk1突变体中，想知道Ser-603磷酸化是否是SUMM2介导的自身免疫修复所必需的。我们在mekk1背景下产生了5个MEKK1和5个MEKK1S603A转基因株系。在所有MEKK1转化的植株中，矮化表型均得到完全恢复(图9C和9D)。
model图我就不解释了，我剖析的比较透彻且画的比较详细了。
证明思路
1.在面对多种pattern处理时，MAPKKK3/5 被磷酸化。
2.在各种pattern处理后，MAPKKK3/5能激活 MAPKKK3/5。
3.在各种pattern处理后，MAPKKK3/5能激活防卫基因的表达并能增强抗病性。2与3也就形成了MAPKKK3/5-MAPKKK3/5-防卫基因这条通路。
4.接着通路往上游做，RLCK VII-4家族将PRRs和MAPKKK5联系起来，并且只参与chitin处理后的信号通路。
5.再找磷酸化的位点，发现MAPKKK5 599位的Ser磷酸化对于激活MAPK和行使抗病性是必要的。关键位点最好是在物种和其他基因都保守。
6.MPK6能磷酸化MPKKK5 682/692位的Ser，形成一个正向的loop。
7.发现MAPKKK5 682/692位的Ser磷酸化对于激活MPK3/6和免疫发生是必要的。
8.MEKK1也被RLCK VII-4和MPK4所磷酸化。
9.MEKK1 603-Ser的磷酸化对于MPK4的激活和抑制自发免疫也很重要。
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