我的第一篇简书分享一篇发在science上的一篇article，由中国农大的田丰教授团队完成。之所以选择这一篇，是因为我的遗传学知识不是太扎实，而这篇文章的遗传做的很棒，值得我去精读，精读完成后分享给大家。

Teosinte ligule allele narrows plant architecture and enhances high-density maize yields

简洁版

文章主要鉴定了两个QTL，UPA1(Upright Plant Architecture1)和UPA2，调控玉米株型的直立生长。UPA2的不同功能由自身两bp的多态性所控制，调节下游的RAVL1（一类B3-domain的转录因子），在UPA2-NIL8759不同的（SNP的差异）UPA2展示了对DRL1（DROOPING LEAF1）不同的结合能力，DRL与LG1互作，并且抑制了LG1去激活RAVL1的表达。低水平的RAVL1下调了brd1的表达，随后减少了叶舌区域内在的BR水平，从而减少了叶的角度。而在UPA2-NILw22中，UPA2与DRL1结合能力较低，因此释放了LG1去激活RAVL1的转录，进一步上调了brd1的表达，导致了BR量的增加和叶的角度变大。

1569301088453.png

背景

随着全球人口的日益增多，如何在有限的土地上提高粮食产量从而养活世界上更多的人口是摆在我们面前的一道难题。而植物的直立生长减少了彼此的相互遮挡，保持了植物的光捕获能力，单位面积内可以种植更多的单株，从而提高了整体的产量。前期有人发现了lg1和lg2的突变体，突变体的叶耳和叶舌发育缺陷，从而显示出直立生长的株型，但是因为它的叶直立的不像话，无法应用到育种中，所以研究者就开始寻找一种自然的等位基因来优化植物株型和叶的角度，从而应用到育种中去。

研究思路

mapping到基因后首先从微观上解释为什么该基因会控制植物直立生长

研究者首先在玉米自交系W22和大刍草8759的重组自交系中，mapping到12个与叶角度相关的QTLs，其中效应最大的是UPA2（Upright Plant Architecture2）。接着就做了UPA2在不同背景下（w22和8759）的重组自交系。从fig1的B、C图可以看到，叶的角度有明显的差异，UPA2在8759背景下的近等基因系叶的角度更小一点。

1569304674658.png

扫描电镜观察到（如fig1D、E所示），UPA2-NIL8759 有更窄的叶舌带，导致了成熟期减少的叶耳的大小。

1569305331181.png

叶耳区域的厚壁组织为叶片提供了机械强度。UPA2-NIL8759在近轴端包含了更多层的厚壁组织细胞，如fig1F，G所示。

1569305586283.png

遗传上解释UPA2和RAVL1的关系

如fig1的H，I，J所示，UPA2的部分定位在240bp的非编码区域，下游9540bp是RAVL1。因此，这个UPA2的240bp的区域可能作为一个远端的顺式作用元件来调节RAVL1的表达。同时得到在UPA2-NIL8759发育的叶中，RAVL1的表达水平较低，且定位于核中，如fig.S5A,S5B所示（leaf5指的是五叶期的成熟叶，即5th叶完全展开，leaf6和leaf7代表不成熟叶）。

1569308128989.png 1569308753578.png

找到一个相互作用的基因后，开始从遗传上gain、lose function来研究这个基因的功能

研究者分别从基因水平和转录水平构建了lose function体系，knock out和knock down掉 RAVL1后，叶夹角变小，过表达RAVL1后叶夹角变大，如fig2所示（原因自行看原文），因此说明RAVL1正调节叶的夹角。

1569309956235.png

从一级序列上解释，“SNP”导致蛋白结合的变化，进而影响功能的行使

测序寻找UAP2的240bp区域的序列的变异，得到4种序列的不同，包括一个SNP，3种1-2bp的多态性。他们就想知道，序列上的这种变化是否与保守的调节叶夹角的机制有关。分析SNP所处的位置发现，S2的位置变异发生在C2-C2结合的motif，早先有人报道，玉米的drl1和drl2包含C2C2 domain，无义突变后造成了叶角度变大。所以接下来他们就想是否DRL1蛋白可以结合到UAP2。

1569310580023.png

EMSA试验得到，如fig3B，在包含TG的UPA2中，DRL1蛋白显示出更高的亲和力。由于先前得到RAVL1的表达pattern在核中，DRL1可以结合到RAVL1的调节区域上，所以接下来他们用ChIP-qPCR。如fig3C，富集得到了大量的包含S2变异的C2C2-结合motif，因此这两个结果就揭示，UPA2的S2区域的变异导致了DRL1与其亲和能力的变化。

1569312452722.png

建立与已知相似表型基因的联系

背景中已经提到lg1和lg2突变体与叶夹角的关系，作者想知道RAVL1和lg1、lg2的关系，在突变体背景下进行了一系列的基因表达量的检测，如figS12所示，结果发现在lg1和lg2突变体下，RAVL1的表达被抑制，而在RAVL1-ko下，lg1和lg2的表达没有改变。综上说明，lg1和lg2作为RAVL1的上游发挥功能。

1569313353293.png

研究者接下来想做的更精细点，想知道LG1是否调节RAVL1的表达。过去的研究证明，含SBP domain的蛋白能够识别并结合GTAC motif，而在RAVL1的promoter区发现了两个基本的GTAC位点，如fig.3A所示。如fig.3D，E所示，EMSA揭示LG1能够结合到RAVL1 promoter 的GTAC位点上，且ChIP-qPCR揭示F4 fragment的富集。总之，可以说明，LG1确实可以调节RAVL1的表达。

1569314090217.png

综合两个独立的EMSA和ChIP-qPCR结果分析

两个独立的EMSA和ChIP-qPCR得到，LG1能够结合到RAVL1的promoter区，DRL1能够结合到UPA2附近的S2区，而这个UPA2附近的S2区可以作为顺式作用元件来调节RAVL1。此时，最直接了当的是看，LG1和DRL1是否可以发生物理上的互作。如fig.4A和4B所示，通过Y2H和split-luciferase complementation，体内体外证明LG1和DRL1互作。

1569314547156.png

在玉米原生质体顺转基因发现，8759报告基因比w22报告基因展示了更低的LUC活性。单独过表达LG1诱导了8759和w22报告基因的活性，单独过表达DRL1却抑制了这两个报告基因LUC的活性，而共表达LG1和DRL1抑制了LG1激活的LUC活性。8759报告基因比W22报告基因展示了更低的LUC活性。综上，DRL1与LG1互作，并且减弱了LG1对RAVL1的转录激活作用。

1569318958554.png

做完了UPA2，接下来就是UPA1

如fig.5A，5B所示，UPA1的近等基因系中，在不同叶位改变叶夹角中，UPA1的作用也很大。mapping到UPA1到一个223kb的区域，结果这个区域只有一个基因，brd1，它催化了BR合成的最后一步反应。在RAVL1-ko的材料中，brd1表达下调，brd1-OE的材料中，RAVL1的表达没有差异。因此，RAVL1作为brd1的上游。通过Y1H，EMSA，ChIp-qPCR证实，如fig5.G,H，RAVL1可以结合到brd1的promoter上去。在玉米原生质体中瞬时表达得到，如fig5.I，J中所示，RAVL1可以结合到brd1的promoter上，从而激活LUC的表达。

1569329448678.png 1569330263798.png

文章到这里，其实就可以得到一个UPA2-UPA1相关的调节叶夹角的模型，模型内容如前文简述所示。

接下来就是该QTL的应用部分

对现代玉米品种基因筛选得到，现代玉米都不携带S2位置的TG等位基因，再分析大刍草的基因型发现，只有4.4%的大刍草携带S2位置的TG等位基因，因此可以说明，大刍草S2位置是一个相对稀有的变异点，在现代玉米驯化中丢失。

随着密度的增加，UPA2-NIL8759 单株产量的下降速度变缓，且总产量比UPA2-NILw22要高，如fig6.A和B所示。为了单独查看UPA2-NIL8759在现代育种中的应用，将该位点在现代栽培种nongda108中做了应用，如fig5.C和D中所示，与WT相比，随着种植密度的增加，Nongda108-upa2-8759显示出更高的产量。综上可以说明，UPA2位点既可以改变现代栽培玉米的株型，也可以提高玉米在高密植条件下的产量。采用现代基因编辑的技术，对UPA2进行了KO，也得到了了相似的结论。

组会讨论内容

1.文章的卖点在于high-density。

2.对于RAVL1和UPA2 C2-C2 domain中间的9.5kb内的基因在整个功能的发挥中起的作用并没有说明。

3.该位点在大刍草中保留，而在现代栽培玉米种丢失可能是因为，以前选品种的时候并没有考虑耐密植的问题，主要想让叶子平展，获得更大的光捕获面积，从而提高单株产量。而现代由于人口压力要考虑密植问题。