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RNA Interference and Gene Silencing — History and Overview
May 20, 2002
转录后基因沉默（PTGS）最初被认为是一种仅限于矮牵牛和其他几种植物的奇异现象，现在已成为分子生物学中最热门的话题之一。 近几年已经清楚的是，PTGS在植物和动物中都存在，并且在病毒防御和转座子沉默机制中起作用。 然而，也许最令人兴奋的是PTGS的新兴应用，尤其是RNA干扰（RNAi）——通过引入双链RNA（dsRNA）引发的PTGS-作为敲除多种特定基因表达的工具生物。
RNAi是如何发现的？它是如何工作的？也许更重要的是，如何将其用于功能基因组学实验？本文将简要回答这些问题，并为您提供有关PTGS和RNAi研究的深入信息。
发现一个奇怪的现象：植物共抑制和PTGS
十多年前，在矮牵牛中进行了令人惊讶的观察。在尝试加深这些花的紫色时，Rich Jorgensen及其同事在强大的启动子控制下引入了色素生成基因。与其预期的深紫色不同，许多花朵似乎杂色甚至是白色。乔根森称观察到的现象为“共抑制/cosuppression”，因为导入基因和同源内源基因的表达均被抑制。
最初被认为是矮牵牛的怪癖，后来发现共抑制在许多植物物种中都发生。还已经在真菌中观察到了它，并且在克雷索氏菌中被特别好地表征，在那儿它被称为“抑制/quelling”。
但是什么原因导致这种基因沉默呢？尽管在某些植物中转基因诱导的沉默似乎涉及基因特异性甲基化（转录基因沉默或TGS），但在另一些植物中，沉默发生在转录后水平（转录后基因沉默或PTGS）。在后一种情况下的核运行实验表明，产生了同源转录本，但是它在细胞质中迅速降解并且没有积累。
转基因的引入可以触发PTGS，但是也可以通过引入某些病毒来诱导沉默。触发后，PTGS由可扩散的反式作用分子介导。这首先在Neurospora中得到证实，当时Cogoni及其同事证明了基因沉默可以在异核生物株的核之间转移。后来在Palauqui及其同事通过将沉默的，含转基因的来源植物嫁接到未沉默的宿主中而在宿主植物中诱导PTGS时在植物中得到证实。从线虫和苍蝇的工作中，我们现在知道负责植物中PTGS的反式作用因子是dsRNA。
dsRNA基因沉默：RNA干扰
RNAi在线虫中被发现
dsRNA可能导致基因沉默的第一个证据来自线虫秀丽隐杆线虫的工作。七年前，研究人员Guo和Kemphues试图使用反义RNA来关闭par-1基因的表达，以评估其功能。正如预期的那样，反义RNA的注入破坏了par-1的表达，但令人困惑的是，正义链控制的注入也确实如此。
直到三年后，这个结果还是一个谜。然后，Fire和Mello首先将dsRNA（正义链和反义链的混合物）注入到秀丽隐杆线虫中。与仅注射有义或反义链相比，这种注射导致沉默效率更高。实际上，每个细胞仅注射几个分子的dsRNA就足以完全沉默同源基因的表达。此外，将dsRNA注入蠕虫的肠道不仅导致整个蠕虫的基因沉默，而且还导致其第一代后代的基因沉默。
RNAi的效力激发了Fire和Timmons尝试喂养线虫细菌，这种细菌经过改造后可以表达与秀丽隐杆线虫unc-22基因同源的dsRNA。令人惊讶的是，这些蠕虫形成了unc-22 null-like表型。进一步的研究表明，将蠕虫浸入dsRNA中也能够诱导沉默。这些策略使大量线虫暴露于dsRNA，从而使大规模筛选能够选择RNAi缺陷的秀丽隐杆线虫突变体，并导致对该生物体内的大量基因敲除研究。
果蝇中的RNAi
在果蝇中也观察到了RNAi。尽管将酵母工程化以产生dsRNA然后喂给果蝇的策略无法奏效，但用dsRNA显微注射果蝇胚胎确实会产生沉默（2）。也可以通过用“基因枪”将dsRNA“射击”到果蝇胚胎中，或通过工程蝇携带带有待沉默基因的反向重复序列的DNA来诱导沉默。在过去的几年中，这些RNAi策略已被用作果蝇生物，胚胎裂解液和细胞中的逆向遗传学工具，以表征各种功能丧失的表型。
RNAi的生化机制
那么注射dsRNA如何导致基因沉默呢？在过去的几年中，许多研究小组都在努力地回答这一重要问题。鲍尔科姆和汉密尔顿的一项重要发现提供了第一个线索。他们鉴定出在非沉默植物中共抑制的植物中约25个核苷酸的RNA。这些RNA与被沉默基因的有义和反义链都是互补的。
在果蝇中的进一步工作-使用胚胎裂解液和源自S2细胞的体外系统-为受试者提供了更多的信息。在一系列值得注意的实验中，Zamore及其同事发现，添加到果蝇胚胎裂解物中的dsRNA被加工成21-23个核苷酸。他们还发现，同源内源性mRNA仅在与导入的dsRNA相对应的区域被切割，并且切割以21-23个核苷酸的间隔发生。迅速地，RNAi的机制变得清晰起来。
RNAi机制的当前模型
生化和遗传方法（请参阅下面的“ PTGS和RNAi涉及的基因和酶”中有关用于理解RNAi的遗传方法的讨论）都形成了RNAi机制的当前模型。在这些模型中，RNAi包括启动步骤和效应器步骤（另请参见参考文献3的Flash动画“ RNAi如何工作？”）。
Flash Animation: How Does RNAi Work?
Hammond, S.M., Caudy, A.A., Hannon, G.J. (2001) Post-transcriptional Gene Silencing by Double-stranded RNA. Nature Rev Gen 2: 110-119.
www.nature.com/nrg/journal/v2/n2/animation/
nrg0201_110a_swf_MEDIA1.html
在起始步骤中，将输入的dsRNA消化成21-23个核苷酸的小干扰RNA（siRNA），也称为“引导RNA”。有证据表明，dscer酶是dsRNA特异性核糖核酸酶RNase III家族的一员，Dicer酶以ATP依赖性，加工方式连续切割dsRNA（直接或通过转基因或病毒引入）。连续的切割事件将RNA降解为19-21 bp的双链体（siRNA），每个双链体都带有2个核苷酸的3'突出端。
在效应子步骤中，siRNA双链体与核酸酶复合物结合形成所谓的RNA诱导的沉默复合物或RISC。激活RISC时，需要依赖ATP的siRNA双链体展开。然后，活性RISC通过碱基配对相互作用靶向同源转录本，并从siRNA的3'末端切割〜12个核苷酸的mRNA。尽管目前尚不清楚切割的机理，但研究表明，每个RISC都包含单个siRNA和一个与Dicer不同的RNase。
由于RNAi在某些生物体中的显着效力，因此还提出了RNAi途径内的扩增步骤。扩增可通过复制输入的dsRNA（可产生更多的siRNA）或通过siRNA自身的复制来进行（请参见下面的“ RNA依赖性RNA聚合酶的可能作用”）。替代地或另外，可以通过RISC的多个周转事件来实现扩增。
PTGS和RNAi涉及的基因和酶
RNA依赖的RNA聚合酶的可能作用
Neurospora，秀丽隐杆线虫和拟南芥的遗传筛选已鉴定出一些基因，这些基因似乎对PTGS和RNAi至关重要。其中一些，包括Neurospora qde-1，拟南芥SDE-1 / SGS-2和秀丽隐杆线虫ego-1，似乎编码RNA依赖性RNA聚合酶（RdRPs）。乍一看，可以假设这证明RNAi需要RdRP活性。如果RdRP在切割前直接扩增dsRNA或直接扩增siRNA，RdRP的存在当然可以解释dsRNA诱导的沉默的显着效率。但是这些基因的突变体具有不同的表型，这使得RdRP在RNAi中的作用难以辨别。
在秀丽隐杆线虫ego-1突变体（“ ego”代表“ glp-1增强剂”）中，RNAi在体细胞中正常运行，但在主要表达ego-1的种系细胞中有缺陷。在拟南芥SDE-1 / SGS-2突变体中（“ SGS”代表基因沉默的抑制物），当通过内源复制的RNA病毒引入dsRNA时，会产生siRNA，而通过转基因引入时则不会产生siRNA。已经提出在这些突变体中病毒RdRP可能替代了拟南芥酶。尽管在果蝇或人类中均未发现RdRP的同源物，但最近在果蝇胚胎裂解液中报道了RdRP的活性。一种称为“随机降解PCR”模型的扩增模型表明，RdRP使用siRNA的导链作为目标mRNA的引物，从而为Dicer生成了dsRNA底物，从而产生了更多的siRNA。在蠕虫中发现了支持该模型的证据，而从果蝇胚胎裂解物中获得了反驳该模型的实验结果。
RNAi引发剂
两种秀丽隐杆线虫基因rde-1和rde-4（“ rde”代表“ RNAi缺陷”）被认为与RNAi的起始步骤有关。这些基因的突变体产生的动物通过注射dsRNA可以抵抗沉默，但是沉默可以通过从没有沉默缺陷的杂合子亲本中传递siRNA来实现。秀丽隐杆线虫的rde-1基因是一个大家族基因的成员，与Neurospora qde-2（“ qde”代表“抑制缺乏”）和拟南芥AGO1基因（“ AGO”代表“ argonaute”）同源。 ”；以前已确定AGO1与拟南芥的发育有关。尽管这些基因在PTGS中的功能尚不清楚，但已将RDE-1家族的哺乳动物成员鉴定为翻译起始因子。有趣的是，对共抑制有缺陷的AGO1拟南芥突变体在叶片发育中也表现出缺陷。因此，PTGS中涉及的某些过程或酶也可能参与发育。
RNAi效应子
PTGS的效应子步骤的重要基因包括秀丽隐杆线虫rde-2和mut-7基因。这些基因最初是从不能将RNAi传递给其纯合后代的杂合突变蠕虫中鉴定出来的。带有突变的rde-2或mut-7基因的蠕虫表现出有缺陷的RNAi，但是有趣的是，它们还证明了转座子活性水平的提高。因此，转座子的沉默似乎是通过与RNAi和PTGS相关的机制发生的。尽管尚未鉴定出rde-2基因产物，但mut-7基因编码的蛋白与RNase D的核酸酶结构域具有同源性，并且与人的Werner综合征（一种快速衰老疾病）有关（。也许这种蛋白质是目标RNA降解所需的核酸酶活性的候选者。
PTGS具有悠久的历史
遗传和生物化学方法的发现都表明PTGS具有深厚的进化根源。有人提出，PTGS可能是抵御转座子或RNA病毒的防御机制，也许是在动植物分化之前发展的。
有趣的是，许多研究人员指出，RNAi所需基因的破坏通常会导致严重的发育缺陷。该观察结果提示RNAi与至少一个发育途径之间存在联系。
一组称为小时序RNA（stRNA）的小RNA分子通过翻译靶标转录物来调控秀丽隐杆线虫的发育时间。研究表明，将秀丽隐杆线虫lin-4和let-7 stRNA从这些较长的转录本折叠成茎环结构后，由70个核苷酸的转录本生成。折叠的RNA分子被切酶切割（产生秀丽隐杆线虫中的DCR-1），以产生22 nt stRNA。因此，Dicer既生成siRNA，也生成stRNA，并代表RNAi和stRNA途径的交点。
最近，在果蝇，秀丽隐杆线虫和HeLa细胞中发现了近100个另外的〜22 nt RNA分子，称为microRNA（miRNA）。这些miRNA与lin-4和let-7非常相似，它们是由折叠成茎环二级结构的前体RNA分子形成的。据信，新发现的约22 nt的miRNA在调节基因表达中起作用，并且已知其中至少有两个需要Dicer来生产。似乎在整个进化过程中，将小RNA用于基因调控和RNAi是一个共同的主题。
在哺乳动物细胞中诱导RNAi-从机理到应用
长dsRNA导致的非特异性基因沉默
尽管已经在多种生物（植物，原生动物，昆虫和线虫）中观察到了RNAi的天然存在，但哺乳动物细胞中存在RNAi的证据需要花费更长的时间才能建立。将长dsRNA分子（> 30 nt）转染到大多数哺乳动物细胞中会导致基因表达的非特异性抑制，这与其他生物体中看到的基因特异性抑制相反。这种抑制作用归因于抗病毒反应，它通过两种途径之一发生。
在一种途径中，长dsRNA激活蛋白激酶PKR。活化的PKR进而磷酸化并使翻译起始因子eIF2a失活，从而导致翻译受阻。在另一种途径中，长dsRNA激活RNase L，导致非特异性RNA降解。
许多研究小组表明，小鼠胚胎干（ES）细胞和至少一种胚胎来源的细胞系不存在dsRNA诱导的抗病毒反应。因此，可以使用长dsRNA沉默这些特定哺乳动物细胞中的特定基因。但是，抗病毒反应无法在大多数其他哺乳动物细胞类型中使用长dsRNA诱导RNAi。
siRNA绕过抗病毒反应
有趣的是，长度小于30 nt的dsRNA不会激活PKR激酶途径。这一观察结果以及对长dsRNA会在蠕虫和果蝇中裂解形成siRNA以及siRNA能够在果蝇胚胎裂解液中诱导RNAi的认识促使研究人员测试引入siRNA是否会在哺乳动物细胞中诱导基因特异性沉默。实际上，发现通过瞬时转染引入的siRNA以序列特异性方式有效地诱导了哺乳动物培养细胞中的RNAi。 siRNA的有效性各不相同-最有效的siRNA可使靶RNA和蛋白质水平降低> 90％。事实证明，最有效的siRNA是21 nt dsRNA，带有2 nt 3'突出端。 siRNA的序列特异性非常严格，因为siRNA及其靶mRNA之间的单碱基对错配会显着降低沉默。不幸的是，并非所有具有这些特征的siRNA都是有效的。其原因尚不清楚，但可能是位置效应的结果。有关设计siRNA的最新建议，请参见“ siRNA设计”。
RNAi作为功能基因组学的工具
尽管RNAi和PTGS的历史和机理令人着迷，但许多研究人员对RNAi作为功能基因组学工具的潜在用途感到最为兴奋。 RNAi已经被用于确定果蝇，秀丽隐杆线虫和几种植物中许多基因的功能。知道可以通过转染siRNA在哺乳动物细胞中诱导RNAi，因此许多研究人员开始将RNAi用作人类，小鼠和其他哺乳动物细胞培养系统的工具。
在哺乳动物细胞的早期实验中，siRNA是化学合成的（Ambion是提供定制siRNA合成的多家公司之一）。最近，Ambion推出了一种通过体外转录生产siRNA的试剂盒（Silencer™siRNA构建试剂盒），这是化学合成的廉价替代品，特别是在需要合成多种不同siRNA的情况下。制备完成后，可通过瞬时转染将siRNA引入细胞。由于功效的差异，大多数研究人员会将3–4个siRNA合成为靶基因，并进行先导实验以确定最有效的一种。用这种方法已经观察到超过90％的瞬态沉默。
到目前为止，将dsRNA注射并转染到细胞和生物中已经成为传递siRNA的主要方法。尽管沉默效果持续了几天，而且似乎确实转移到了子细胞上，但最终确实减弱了。但是，最近，许多研究小组已经开发出表达载体，以在瞬时和稳定转染的哺乳动物细胞中连续表达siRNA。这些载体中的某些已被工程化以表达小发夹RNA（shRNA），该小发夹RNA在体内被加工成能够进行基因特异性沉默的siRNA样分子。载体包含在聚合酶III（pol III）启动子和4-5胸腺嘧啶核苷转录终止位点之间的shRNA序列。转录物终止于终止位点的第2位（pol III转录物自然缺少poly（A）尾巴），然后折叠成具有3'UU突出端的茎环结构。 shRNA的末端在体内进行加工，将shRNA转化为约21 nt siRNA样分子，从而启动RNAi。后一个发现与秀丽隐杆线虫，果蝇，植物和锥虫中的最新实验有关，其中折叠成茎环结构的RNA分子诱导了RNAi（在3中进行了综述）。
由另一个研究小组开发的另一种siRNA表达载体在独立的pol III启动子的控制下编码有义和反义siRNA链。该载体的siRNA链与其他载体的shRNA一样，具有5个胸苷终止信号。两种类型的表达载体的沉默功效均与瞬时转染siRNA所诱导的沉默功效相当。
最近有关RNAi的研究席卷了整个研究领域。快速，轻松地创建功能丧失表型的能力使研究人员急于尽可能多地了解RNAi和有效siRNA的特征。将来，RNAi甚至有望有望开发出基因特异性疗法。人们已经学到了很多有关这种强大技术的知识，但是几乎每天都可以获得其他信息（请参阅RNA干扰资源以了解最新的RNAi研究和工具）。可以肯定地说，RNAi正在改变功能基因组学领域。
Additional Resources
RNA interference
www.nature.com/nature/fow/000316.html
专业术语
共抑制-由于引入转基因或被病毒感染而导致的内源基因沉默。这个术语可以指转录后（PTGS）或转录（TGS）级别的沉默，已被植物研究人员广泛采用。
转录后基因沉默（PTGS）-通过引入同源dsRNA，转基因或病毒引起的内源基因沉默。在PTGS中，沉默基因的转录物是合成的，但不会积累，因为它会迅速降解。这是一个比RNAi更通用的术语，因为它可以通过几种不同的方式触发。
抑制-引入转基因诱导的神经孢菌中的PTGS。
RISC-RNA诱导的沉默复合物。核酸酶复合物，由蛋白质和siRNA组成（见下文），靶向并破坏与复合物中siRNA互补的内源性mRNA。
RNA干扰（RNAi）-直接引入dsRNA诱导的转录后基因沉默（PTGS）。研究人员首先对秀丽隐杆线虫使用“ RNA干扰”一词。
siRNA-小干扰RNA。 PTGS的当前模型表明，这些21-23个核苷酸的dsRNA介导PTGS。 siRNA的引入可以在哺乳动物细胞中诱导PTGS。 siRNA显然是通过直接或通过转基因或病毒导入的dsRNA裂解体内产生的。 RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP）的扩增可能发生在某些生物中。将siRNA掺入RNA诱导的沉默复合物（RISC）中，将复合物引导至同源内源性mRNA，其中复合物切割转录物。
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