siRNA

作者: 嘉期几许 | 来源:发表于2019-05-30 21:50 被阅读0次

    Pre:离心,10000rpm,2min
    管里加Depc水
    RNA oligo,加125ul depc水
    NC,62.5 depc水
    转染全程避光~


    跑Wb上样顺序:blank,NC, Sirna


    铺板:6孔板
    细胞贴壁(一般6h)后,换无血清培养基(一般饥饿6-8h),等待长到50%,转染
    3个序列,1个nc,1个lipo
    每个序列,两个副孔


    siRNA

    转染时机:细胞长到超过50%(60%~70%)
    白的是NC
    小干扰7ul,nc5ul,
    先配制:7ul小干扰混到250ul无血清培养基(257),lipo5ul配在125ul无血清培养基里(130ul)
    上述两者混合10min左右,不能超15分钟
    Blank. 375无血清培养基(可以不加)
    total:s1:14ul+500ul, lipo10ul+250ul
    s2:14ul+500ul, lipo10ul+250ul
    s3:14ul+500ul, lipo10ul+250ul
    nc:10ul+500ul,lipo10ul+250ul

    滴管吸细胞里面的带血清的培养基,pbs洗细胞,
    每个加1ml无血清培养基

    小干扰混匀完毕 ,加入细胞内
    6-8小时之后换含血清培养基(10%比例),转染后6h即可看转染效率。荧光显微镜

    48h后(长到90%)收蛋白RNA, protein
    收蛋白:Pbs各个孔再加1ml,用来洗细胞,把两个孔的细胞放在一个ep管里
    提取细胞沉淀,3000rpm,5min


    1.配液
    2.lipo和转染试剂混5min
    3.洗细胞:吸出血清,加无血清培养基液1ml洗两遍,加在壁上。加1ml培养基液

    4.加配好的试剂,等待 20min。一定不能超时。
    加液体,6小时之后换血清培养基
    等长 到90%,收细胞。 长1-2天?看细胞种类

    收之后,
    PBS. 洗细胞1遍
    Tbst。WB
    NC blank. 各设几个???
    随意,nc4个,blank 2个

    95%酒精,酒精灯
    其他75%
    灌满酒精
    拿进去的东西要喷
    滴管,离心管,冻存管,照15分钟

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