Pre:离心,10000rpm,2min
管里加Depc水
RNA oligo,加125ul depc水
NC,62.5 depc水
转染全程避光~
跑Wb上样顺序:blank,NC, Sirna
铺板:6孔板
细胞贴壁(一般6h)后,换无血清培养基(一般饥饿6-8h),等待长到50%,转染
3个序列,1个nc,1个lipo
每个序列,两个副孔
siRNA
转染时机:细胞长到超过50%(60%~70%)
白的是NC
小干扰7ul,nc5ul,
先配制:7ul小干扰混到250ul无血清培养基(257),lipo5ul配在125ul无血清培养基里(130ul)
上述两者混合10min左右,不能超15分钟
Blank. 375无血清培养基(可以不加)
total:s1:14ul+500ul, lipo10ul+250ul
s2:14ul+500ul, lipo10ul+250ul
s3:14ul+500ul, lipo10ul+250ul
nc:10ul+500ul,lipo10ul+250ul
滴管吸细胞里面的带血清的培养基,pbs洗细胞,
每个加1ml无血清培养基
小干扰混匀完毕 ,加入细胞内
6-8小时之后换含血清培养基(10%比例),转染后6h即可看转染效率。荧光显微镜
48h后(长到90%)收蛋白RNA, protein
收蛋白:Pbs各个孔再加1ml,用来洗细胞,把两个孔的细胞放在一个ep管里
提取细胞沉淀,3000rpm,5min
1.配液
2.lipo和转染试剂混5min
3.洗细胞:吸出血清,加无血清培养基液1ml洗两遍,加在壁上。加1ml培养基液
4.加配好的试剂,等待 20min。一定不能超时。
加液体,6小时之后换血清培养基
等长 到90%,收细胞。 长1-2天?看细胞种类
收之后,
PBS. 洗细胞1遍
Tbst。WB
NC blank. 各设几个???
随意,nc4个,blank 2个
95%酒精,酒精灯
其他75%
灌满酒精
拿进去的东西要喷
滴管,离心管,冻存管,照15分钟
网友评论