各类组学研究中，一方面传统的组织块测序能获得细胞群体的总体平均特征而识别不了单个细胞的特征，其分辨率较低。如同撰稿人的照片一样当分辨率低的时候只能看清轮廓。另一方面，组织块测序忽略了稀有细胞的作用。正如真理掌握在少数人手里一样，那部分稀有细胞群往往起着重要功能。如果后续分离单细胞进行测序，就能够以更高的分辨率揭示细胞间的差异及其在微环境中的功能情况。单细胞测序由于上述独特的分辨率高且能获得稀有细胞信息的优势，其发表在顶级期刊上的文章居多。
1 绘制细胞图谱鉴别异常细胞类型及起源
单细胞谱图的构建，获取不同细胞的功能情况。对每个细胞表达情况进行数据降维（t-SNE、UMAP分型），基于聚类分析结果对不同类群的细胞进行注释，寻找细胞群之间的差异。多数单细胞研究都是基于细胞图谱发表描述性文章。
2 低成本发掘未知细胞种类
获得新的细胞类型，属于新科学发现，不仅有助于后续细胞功能研究，而且还能有助于临床应用。如循环肿瘤细胞（circulating tumor cells）的发现，对于癌症患者的临床诊断治疗有很大的帮助。
3 几个月搞定需多年时间的发育研究
获取细胞的分化过程中是由于哪些特定基因改变的结果，在发育生物学中至关重要。单细胞测序能快速高效地对特定细胞群进行分化轨迹与谱系示踪分析，从而鉴定细胞不同分化状态下的潜在调节基因。
目前10x Genomics平台操作便捷且性价比高，成为科研工作者竞相追逐使用的单细胞捕获平台。基于该平台在各个领域的文章数目来看，其主要应用的研究方向是单细胞转录组测序。
特别是近年来10x Genomics平台的文章发表与日俱增，足以说明单细胞测序技术正在逐步成为科研工作者主流关注的热点。
10X官网公布文献发表情况
高分文章往往离不开严谨的实验，对于研究者来说生物学实验需要遵守的一条亘古不变的准则是：基于生物学问题选择对应的研究方法。单细胞测序研究亦是如此。目前单细胞转录组领域热门的有两种平台技术：如果有目的细胞群作为候选研究对象，并且要获取目的稀有细胞群的基因表达及转录本的可变剪切、基因融合等变异信息，这种需要mRNA测到全长且覆盖度高，可以选择Smart seq2这种低通量单细胞方法进行后续的实验；如果为了获得细胞谱图，尽可能的检测更多的细胞类型，则选择海量单细胞测序（10x Genomics）更加合适。
How to design a single-cell RNA-sequencing experiment: pitfalls, challenges and perspectives, Brief Bioinform. 2019;20(4):1384-1394. IF=8.99 https://doi.org/10.1093/bib/bby007
一旦确定好了单细胞的研究方法，后续就要考虑大部分研究者都比较头疼的问题——组织解离的方法。组织能否成功解离单细胞也就决定了后续实验是否能顺利进行，一般组织经过切割成碎片后，会使用特定的酶进行解离，涉及酶浓度、酶解时间、温度等信息，对此可以参考如下文献中的表格：人和小鼠的部分组织类型。当然，单管单细胞一般使用口吸管法、显微切割等方法居多。
组织解离方法
Tutorial: guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies. Nat Protoc.2018;13(12):2742-2757.IF:10.419 doi:10.1038/s41596-018-0073-y
单细胞研究思路
总结目前单细胞转录组测序相关文章的内容结构，发文思路一般分五个主要部分：
研究思路
Step1 数据质控
根据数据质控确定测序结果的可靠性。涉及到的参数有：比对率、Q20\Q30、平均每个细胞测得基因数等。
常见数据质控指标
Ba, H., Wang, D., Wu, W. et al. Single-cell transcriptome provides novel insights into antler stem cells, a cell type capable of mammalian organ regeneration. Funct Integr Genomics (2019). IF=3.89https://doi.org/10.1007/s10142-019-00659-2
Step2 细胞分群
对质控后的测序数据进行单细胞表达定量分析，根据各细胞基因表达特征划分细胞群
这个过程需要借助已发表文献或数据库查找出鉴定细胞类型的marker基因，并对不同的细胞类型进行命名（注释鉴定）。此过程即可获得细胞谱图结果。
文献中细胞分群结果
The cellular and molecular landscape of hypothalamic patterning and differentiation from embryonic to late postnatal development. Nat Commun. 2020;11(1):4360. IF: 11.8780 doi:10.1038/s41467-020-18231-z
Step3 挑选目标细胞亚群
该步骤一般需要根据课题前期成果，结合目前研究背景进行挑选目的细胞亚群：
如step2中未注释上的细胞群极有可能是新细胞或稀有细胞，后续可以深入研究。而这种发现一般是可遇不可求，对于经典的单细胞数据挖掘有以下这几种方式：
1 对于单样本测序分析，一般依据各种类型细胞的特异表达基因确定其功能，寻找目标细胞亚群（特定功能细胞）进行后续研究。同时，也可以对一个较大的细胞群进行细分以更加细致地研究细胞类型与功能。
Cre模型中基于与组织特异性相关基因的表达特征将骨髓龛细胞分成三种明显的功能细胞，每种功能细胞又细分成不同的细胞亚型。
The bone marrow microenvironment at single-cell resolution[J]. Nature, 2019: 1. IF= 42.7doi:10.1038/s41586-019-1104-8
2 对于多个样本测序分析。一方面，寻找相同细胞在不同样本中（不同条件处理下）的表达变化，即目标细胞类型在不同条件下的表达变化；另一方面，可以获取不同条件下细胞类型组成占比的变化。进而挖掘出疾病相关（或与研究方向相关）的细胞类型。
（a-c）三个不同取样时间点样本的cluster结果；（d）目的基因标记的细胞群结果；（f）各cluster内表达TCF21基因的细胞占比
“Atheroprotective roles of smooth muscle cell phenotypic modulation and the TCF21 disease gene as revealed by single-cell analysis.” Nat.Med. 2019 Jul 29. IF=30.64 doi:10.1038/s41591-019-0512-5.
Step4 目标亚群重点分析
基于上述锁定的目标细胞群的分析分为两类：
1 对挑选出的目的细胞类型进行功能预测，或与其他类型细胞进行差异比较得出功能异同点，解释生物学现象。或者对其进行细胞通讯分析说明生物学问题。
(a) TNFRSF9表达双峰分布显示抑制性肿瘤的异质性 (b) TNFRSF9+ (activated tumor Tregs, n=519) 和 TNFRSF9-(n=420) 两个细胞群的差异基因火山图 (C) TCGA-LUAD患者的生存曲线（d）关键基因表达热图
Publisher Correction: Global characterization of T cells in non-small-cell lung cancer by single-cell sequencing. Nat Med. 2018;24(10):1628. IF=30.64 doi:10.1038/s41591-018-0167-7
2 分化轨迹与谱系示踪，鉴定不同分化过程中的潜在调节基因，分析关键基因的表达情况。
（a）UMAP展示发育中的下丘脑和丘脑前区细胞群的分化方向（b）树状图显示整个间脑的发育分化层次（c）关键调控基因热图
The cellular and molecular landscape of hypothalamic patterning and differentiation from embryonic to late postnatal development. Nat Commun. 2020;11(1):4360. IF: 11.8780 doi:10.1038/s41467-020-18231-z
Step5 目标细胞功能验证
对上述结果进行细致严谨的实验验证是必不可少的：
1、marker基因表达的验证：RNA FISH、免疫荧光等实验。
2、marker基因相关信号通路的验证
3、对新细胞群的功能验证：流式分选获得特定细胞进行SMART扩增测序验证 ，或者ATAC-seq研究调控机制。
4、还原特定细胞对应于组织的区域：利用gene marker的原位分子杂交。
免疫荧光验证组织中目标细胞表达
Human Intestinal Organoids Maintain Self-Renewal Capacity and Cellular Diversity in Niche-Inspired Culture Condition. Cell Stem Cell. 2018;23(6):787-793.e6. IF: 20.860 doi:10.1016/j.stem.2018.11.016
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