17年的一篇ATVB
EndoMT的概念参考：内皮间质转化EndMT
1. Endothelial Cells Internalize NETs in a Receptor for Advanced Glycation Endproduct– Dependent and Clathrin-Dependent Manner
此前的研究显示，中性粒在NETs的清除中起到重要作用。内皮细胞同样可以内化一系列的细胞物质，包括死亡的中性粒、凋亡的细胞残骸、红细胞等。
由于在NET-driven disorders中，内皮细胞持续暴露在NETs中。因此作者首先探究了内皮是否可以内吞NETs。
Fig 1A：作者将microvascular ciGEnCs (microvascular glomerular endothelial cells) 和 macrovascular HUVECs (macrovascular human umbilical vein endothelial cells)与NETs共孵育。并使用Sytox Orange染色检测了共孵育后不同时间点培养基中的NETs，发现含量出现一个快速的下降。而且在ciGEnCs中更明显。
Fig 1B：使用中性粒细胞弹性蛋白酶（the most abundant protease within NETs）对内皮细胞进行染色，发现NET-treated ciGEnCs中弹性蛋白酶增多。而且弹性蛋白酶与clathrin (网格蛋白) 存在共定位，提示受体介导的内吞形成了clathrin-coated NET-containing endosomes（附件）。在图B中，ciGEnCs的HUVECs在NETs干预后，在clathrin- coated endosomes中发现了NET-derived histones（中图）。
网格蛋白clathrin：细胞胞吞指的是细胞吞下一些分子，将它们拉至细胞内执行不同功能的一个过程。受体介导的内吞是目前公认的生物体摄取生物大分子的途径。这一吞噬过程涉及到生成细胞膜凹陷，这一凹陷会随时间而加深，最终封闭生成一个细胞内球形小泡。在囊泡膜的表面形成一个网格蛋白质包被对这一过程至关重要。在内吞之后，细胞能将包入这种囊泡的细胞膜蛋白降解、回收或者运送到细胞的其他区域。
由于NETs主要是由DNA构成的，因此作者推测RAGE（晚期糖基化终产物受体; promote the uptake of extracellular DNA into endosomes）可能是 NETs internalization的受体。
因此作者使用DNase I对NET进行了处理，降解了NET- derived DNA后，prevented the uptake of NET- derived histones into clathrin-coated endosomes（B图下）。
Fig 1C：在FPS-ZM1（RAGE antagonist）存在的条件下，两种内皮对NETs的内吞都下降。在4度的时候，两种内皮对NETs的内吞也下降，提示uptake of NETs is an active process。
Fig 1
In summary, NETs are rapidly internalized by endothelial cells during an active process involving both RAGE and clathrin.
2. NET-Associated Elastase Promotes Transendothelial Albumin Passage
Fig 2A：尽管内皮对NETs有一个快速的内吞作用，内皮对NETs的phagocytic capacity还是非常有限。额外的大量NETs可以引起内皮细胞内吞的饱和，因此持续存在的胞外NETs。
Supplementary Fig 2A：随后作者使用了HUVEC来探究NETs对内皮的作用。作者发现在高NET浓度下(2-ug DNA/mL)，内皮细胞的胞间连接出现了rapid loss，内皮细胞的monolayer integrity也出现了损害。（NETs处理的内皮细胞从鹅卵石状变成纺锤状，只有PMA处理的内皮则没有这种现象。NETs处理的内皮细胞与4-NQO诱导的凋亡内皮形态也完全不同）
Supplementary Fig 2B：流式检测发现NETs处理的内皮细胞并没有死亡增加。
Fig 2B, C：为了进一步探究NETs对内皮完整性的影响，作者检测了intercellular (junctional) proteins：CD31 和 VE-cadherin的表达，发现NET-treated HUVECs的这两个分子表达显著下降。
Fig 2D：VE-cadherin 的表达下降与逐渐出现的纺锤状mesenchymal样细胞相一致（在24h后最显著）。 处理ciGEnCs得到了与HUVECs一致的结果（Supplementary Fig 2C）。
Fig 2E：为了在功能上评估 endothelial monolayer 的改变，作者进行了albumin passage assay，结果显示和control-treated HUVECs相比，NET-treated HUVECs白蛋白的transendothelial passage显著升高。
由于VE-cadherin 和 CD31 分别是elastase和 MMP9 的底物，(VE-cadherin 和 CD31的丢失是EndMT的标志，参考内皮间质转化EndMT) 作者随后探究了阻断NET-associated elastase 和 MMP9 的活性是否可以阻断这些junctional蛋白的丢失和由此引起的transendothelial albumin passage。
Fig 2F, G：作者使用了sivelestat，一个选择性的elastase inhibitor，对NETs进行了预处理。结果显示处理后VE-cadherin表达增加。transendothelial albumin passage也下降（E）。使用MMP9的中和抗体后CD31的表达也上升 (Supplementary Fig 2D)，但endothelial monolayer integrity并没有显著变化(data not shown)。
Fig 2
Taken together, the extracellular presence of NET-associated elastase promotes the proteolysis of VE-cadherin, which disturbs endothelial monolayer integrity and promotes transendothelial passage of albumin.
3. NET-Associated Elastase Promotes EndMT
β-catenin, a dual function protein involved in cell–cell adhesion and gene transcription, is associated with the cytoplasmic tail of VE-cadherin in endothelial cells. It was previously shown that the loss of cadherin-mediated cell–cell adhesions can promote junctional β-catenin release and induce β-catenin signaling.
Fig 3A-C：和NETs共培养的内皮，β-catenin出现了核转位，在给了sivelestat之后消失。
Fig 3D：为了解释 NET-treated ECs的间质样表型，作者检测了Snail1（an important target gene of β-catenin, which fulfills a key role during EndMT）。发现和NETs共培养之后，Snail1的表达增加，给了sivelestat之后消失。
4. Glomerular NETs Are Associated With Proteinuria and EndMT in Murine LN
随后作者做了体内的验证
Fig 4A：由于lupus nephritis (LN)是一种典型的NET-driven disease，作者首先在MRL/lpr小鼠的肾活检样本中检测了NETs。发现存在NETs。
作者将MRL/lpr小鼠分为了3组，(1) no proteinuria, NP; (2) short-lived proteinuria, SP; and (3) long-lived proteinuria, LP.
Fig 4B：NETs不仅存在于LP，也存在于没有蛋白尿的NP组，在LP组最高。
Fig 4C, D：glomerular NETs的存在与cortical Snail1 和 MMP9 mRNA的表达也是一致的，尤其是在LP组。
Fig 4E：Snail1在proteinuric MRL/ lpr小鼠glomeruli中的表达也出现上调。
Fig 4F, G：而且Snail1蛋白的表达与Snail1 mRNA以及NETs 阳性肾小球呈正相关。
5. Glomerular NETs Are Associated With Proteinuria and EndMT in Human LN
最后作者在人LN上也做了验证
Fig 5A：作者在8例active LN的肾活检样本中检测了NETs的存在。
Fig 5B：NETs阳性的肾小球数与蛋白尿的天数成正比。
有研究显示，受损的DNase I–mediated degradation of NETs与SLE患者出现LN有关。因此作者想要去进一步探究循环DNase I对NETs的降解减少是否与肾小球中存在的 NETs 含量有关。
Fig 5C：作者获取了LN患者的血浆，发现有4例患者的血浆在体外加入NETs时，NETs的降解能力下降。
Fig 5D：然而，PD和GD的anti–double-stranded DNA titers, anti-NET antibody titers, the level of proteinuria, or the percentage of NET-positive glomeruli 之间并没有统计学差异。
Fig 5E：随后作者在severe proteinuria (>10 g/d) 和 minor proteinuria (<1 g/d)的LN患者的活检肾组织中检测了Snail1蛋白的表达，发现severe proteinuria患者的Snail1表达更高。
In summary, there is a correlation between the presence of glomerular NETs and proteinuria in LN, which in turn associated with glomerular Snail1 expression. However, the NET-degrading capacity of plasma could not be correlated to the presence of NETs in the glomeruli of LN patients.
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