关键词

细菌印迹聚合物，抗生素耐药菌ARB，细菌分离，光热灭菌，选择性去除，环境保护

文献信息

“Specific nanoantibiotics for selective removal of antibiotic-resistant bacteria: New insights in bacterial imprinting based on interfacial biomimetic mineralization”

Journal of Hazardous Materials 443 (2023) 130254

https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2022.130254

华中科技大学同济医学院，

摘要

抗生素耐药性已经成为全球日益严重的问题，在保留共存有益菌的同时选择性去除抗生素耐药菌ARB对环境保护至关重要，引起了人们的广泛关注。本研究结合全细胞印迹和表位印迹策略，通过界面仿生矿化和筛选过程，合成了靶向ARB磁性细菌印迹聚合物BIPs。结合数据表明，BIPs对目标细菌有高度特异性亲和力。利用这一BIPs的特异亲和性，开发了一种两步选择性抗菌策略。值得注意的是，BIP纳米抗生素nAbts可以有效破坏ARB，而不伤害有益菌。与非细菌印迹聚合物相比，生物相容性BIP nAbts对废水中有益菌的存活率达到了12.5倍的提高。据我们所知，这是第一次通过界面仿生矿化实现细菌印迹，也是第一次在不损伤有益菌的情况下杀死ARB的报道。

研究背景

城镇水处理抗生素滥用，使细菌出现ARB，这对人类健康造成严重问题。而功能性细菌在水处理中有重要作用。因此，建立可以选择性消除致病性细菌（尤其是ARB）且不伤害有益菌的方法至关重要。

近些年建立的一些新方法忽略的对有益菌的保护。

此外，一些文献表明可以选择性杀死细菌。第一种方法是设计可以识别细菌天然形状的特异性抗菌材料。第二种方法是合成可以通过兼性厌氧菌而非好氧菌选择性产生抗菌自由基的抗菌复合物。第三种方法是制备双功能材料：一部分用于选择性识别G+或G-，另一部分用于杀菌。这些材料的选择性受限。

分子印迹技术MIP通过在交联的聚合物上产生特异性结合，从而产生特异性结合位点。细菌印迹又分为两种：全细胞印迹和位点印迹。这两种方法可有利弊，全细胞印迹可以很容易的找到模板细菌，但得到的细菌印记聚合物BIPs很难让较大的细菌进入空间。表位印迹可以避免整个细菌进入，但通常很难找到印迹位点。但是，由于抗菌物质与有益菌的碰撞，有益菌在很大程度上被去清除。总是，选择性灭菌是一个矛盾的过程。BIPs不仅要能杀死结合菌，同时还要确保有益菌存活。因此，BIPs应该对有益菌有很好的生物相容性，且有益菌的活性不应在杀菌时受影响。

结果与讨论

1.制备BIPs

在磁性颗粒存在的情况下，通过界面仿生矿化，在模板大肠杆菌细胞表面沉淀出一层聚合物。通过超声、洗涤和破碎实现壳裂解和细胞去除，获得了pre-BIPs。根据分子印迹原理，pre-BIPs印迹的腔源于模板细菌表面的化学分子。因为不同细菌表面有一些结构相似的分子（蛋白质和多糖），pre-BIPs对目标菌的选择性不够好。因此，pre-BIPs对非目标菌的非特异性结合应该去除。再次，用一个筛选过程，通过去除对非目标菌有亲和力的BIPs，进而收集对目标菌有高亲和力的BIPs。相比传统用全细胞或表位为模板的BIPs，这一方法是一种混合的印迹过程。用这种方法，BIPs对矿化的壳有高度亲和性，可以特异性识别目标菌。

为验证筛选过程的效率，探究了pre-BIPs和BIPs对目标菌的结合能力。对筛选前后的BIPs对AMP的摄入率进行对比发现两步筛选后的BIPs对目标菌有更高的摄入率。

为进一步证明筛选后BIPs的结合性能增强，选择了参比细菌以研究pre-BIPs和BIPs的结合选择性。首先研究了它们在单菌溶液中的结合能力，pre-BIPs的结合能力比pre-NIPs强，表明pre-BIPs对AMP e.coli和参考细菌比pre-NIPs有更强的亲和力。然而，筛选后，BIPs只对AMP E.coli有识别选择性。这种结合选择性的差异表明筛选后的BIPs的结合选择性显著提高。

筛选后BIPs提高的选择亲和性在一个由目标菌和参考菌组成的二元体系中进一步证明。用特异性因子α评估BIPs对目标菌和参考菌的特异选择性。α=Bound [BIPs]-Bound [NIPs]，Bound []是结合百分比。pre-BIPs和BIPs比相应的pre-NIPs和NIPs对目标菌有更强的结合力。

图1.

2.BIPs表征

图2.

3.BIPs的光热性能

将BIP放在PBS缓冲液中在808 nmNIR激光下照射。BIPs表现出很好的光热转换效率-31.7%和光热稳定性。

图3.

4.BIPs的结合特征

4.1. BIPd的吸附等温线

测定BIPs对不同浓度细菌的吸附能力，当初始细菌OD600=0.12时，BIPs和NIPs对目标菌的吸附达到饱和。吸附数据不能和Langmuir模型和Freundlich模型拟合，表明BIPs对细菌的吸附行为是复杂的（不同于小分子结合）。这可能是因为BIPs有磁性，可以在细菌表面聚集多层结构。

4.2. BIPs的吸附动力学

将BIPs和E.coli孵育不同的时间，以探索动力学吸附过程。为了量化BIPs对目标菌的吸附动力学，采用了拟二级动力学模型考察了吸附速率常数。BIPs对目标菌的快速吸附动力学证实了BIP对选择性吸附AMP E.coli有特异性结合能力。

4.3. BIPs的结合选择性

对比实验表明，细菌细胞壁的主要成分而不是细菌形状在结合中起关键作用。此外还验证了BIPs在混合细菌中是否具有结合选择性。实验数据表明，BIPs对细菌结合腔的置换率分别为金黄色葡萄球菌9.8%、植物乳杆菌11.1%、铜绿假单胞菌24.6%、大肠杆菌41.9%。这种结果的原因可能是因为大肠杆菌和AMO E.coli有更相似的结构。该结果进一步证明了BIPs对溶液中目标菌AMP具有特异性识别能力。

图4.

5.BIPs对有益菌的生物相容性

采用Alamar Blue细菌活性测试对BIPs/NIPs和Fe3O4进行了细胞毒性测试。如图4g，三种材料在低浓度下对植物乳杆菌益生菌均无明显的细胞毒性。然而，随着Fe3O4浓度增加，细胞存活率下降到了51.5%，而BIPs几乎不变。这表明在Fe3O4表面包被生物矿化层显著提高了BIPs的生物相容性，从而导致有益菌在处理过程中得以存活。

6.界面仿生矿化细菌印迹的普适性

选择革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌为模板进行细菌印迹，筛选时，大肠杆菌作为无关菌，结果也证实了生物矿化的印迹聚合物对目标菌有高特异性。

7.BIPs nAbts的抗菌性

7.1. 一步光热抗菌法

在808 nm 2 W/cm 的NIR激光强度下，使用BIPs和NIPs对AMP E.coli进行杀菌。BIPs的杀菌情况：3.3min，50%致死率。

用激光共聚焦，采用基于荧光的细胞存活率实验研究了BIP nAbts的光热效率和光热杀菌性能。用活/死细胞染料SYTO 9和PI区分活（绿色）死（红色）菌。

图5.

7.2. 两步选择性抗菌

a中含AMP E.coli和植物乳杆菌的样品流向含有BIP的b。在搅动下AMP E.coli和BIPs选择性结合后，结合物在磁铁作用下沉淀析出，然后溶液流向c。在筛选细菌后，水注入IV，并且加上NIR光照射。通过这种方法，实现了BIPs的可再生。

图6.

8.BIPs nAbts的重复利用性

在用两步选择性抗菌之后将细菌去除，BIP nAbts仍可继续使用。为验证这一概念，在四次连续循环灭菌后，对使用的BIP nAbts测定其光热和结合性能发现几乎不变。

图7.

研究结论

为实现选择性杀死污染水中的ARB，本研究通过界面仿生矿化和筛选过程合成了BIPs。目前的细菌印迹不仅可以印迹全细菌模板，而且还可以印迹抗原表位的肽或蛋白：用全细胞通过界面仿生矿化获得BIPs，通过细胞表位和聚合物之间的亲和作用筛选特异性识别的BIPs。吸附等温试验、动力学实验，和竞争结合实验证实了BIPs对模板细菌有高结合亲和性。AMP E.coli对BIPs的结合亲和能力几乎是NIPs的2.2倍。有趣的是，当使用其他细菌作为模板时，细菌印迹方法是通用的。由于BIPs的光热性能，建立了一种两步选择性抗菌法有效破坏ARB而不伤害有益菌。在污染水中，BIP nAbts使有益菌的存活率比使用NIP提高了12.5倍。据我们所知，这是第一次通过界面仿生矿化建立细菌印迹方法，也是第一次报道在不伤害有益菌的情况下实现杀死ARB。然而，目前的光热杀菌方法在应用中仍有一些弊端需要解决，如不能完全去除致病性细菌中的耐药基因，仍需要进一步改进，如可以将更有效安全的抗菌方法和BIPs结合去除ARB和细菌内的耐药基因。我们实验室通过光催化杀菌开展了这项研究。此外，保留的有益菌可以进行进一步的处理、生物处理，BIP nAbts正在尝试结合用于降解废水中的有机污染物和重金属。因此，我们认为本研究中合成的BIP nAbts在选择性抗菌应用中有很大潜力，未来可用于水净化、生物处理、环境生物修复等其他环境友好应用。