文献
2023
Nature Genetics
Chromosome-level genomes of three key Allium crops and their trait evolution
课题背景
（1）葱属属于天门冬目石蒜科，包括洋葱（Allium cepa L.）、大蒜（Allium sativum L.）和大葱（Allium fistulosum L.）等，是一类重要的经济作物。非洲百合（Agapanthus africanus）属于天门冬目中的石蒜科，是一种生长在非洲南部的多年生草本植物，具有广泛的观赏和药用价值。
（2）葱属植物的用途广泛。大多数葱属植物含硫化物，因此具有特殊的风味和营养价值。葱属植物如何演化出这种重要性状在很大程度上仍未知。为了解决这个问题，已经有研究对葱属植物进行了比较基因组分析，但是由于葱属植物具有较大的基因组，较多的重复系列，仅仅依赖短读长的测序手段得不到很好的分析结果。
亮点
在本研究中，作者组装了三个重要的葱属作物（洋葱（2n = 2x = 16）、大蒜（2n = 2x = 16）和大葱（2n = 2x = 16））的基因组，另外还组装了非洲百合（Agapanthus africanus, 2n = 4x = 30）的基因组用作外群 ，为葱属作物的进一步研究提供了重要资源。
结论1 染色体水平基因组的组装
Fig 1a-b
Table 1
作者使用PacBio数据和Hi-C数据组装了四个物种的基因组（Fig 1a-b），洋葱为15.78Gb，大蒜为15.52Gb，大葱为11.17Gb，非洲百合为10.48Gb (Table 1)，与流式分析的结果一致。三种葱属作物的contig N50均优于已发表大作物基因组。三个葱属作物和非洲百合的参考基因组QV值介于55.38–69.61，表明其具有非常高的单碱基准确性。
Fig 1c-e
作者对这四个物种以及其他物种进行了系统发育分析，发现这三个葱属物种聚集在一起形成一个单系群，该单系群与非洲百合在69.2个百万年前发生分化（Fig 1c）。通过共线性分析发现，在大葱-大蒜和洋葱-大葱的比较中存在明显的大规模倒位（Fig1a, d）。此外，作者也比较了新组装的大蒜基因组和之前发表的大蒜基因组的共线性，发现两者具有极好的共线性，说明该参考基因组的质量较高（Fig 1e）。
对重复序列的注释显示，在四个基因组中LTR-RTs占主导地位，Copia（8.90–52.16%）和Gypsy（40.26–54.84%）是两个最大的LTR家族。此外，LTR-RTs的分化分析显示，非洲百合在约10%的分化处具有尖锐集中的Copia峰值，而葱属植物显示较为平坦的分布。对于Gypsy类型，四个物种显示出更相似的分布。
Extended Data Fig. 3
进一步，作者通过基因家族扩张和基因进化分析发现，显著扩张的基因家族和受到正选择的基因与防御功能和葱属重要化合物合成相关（Extended Data Fig. 3）.
结论2 葱属特有的多倍化事件
Fig 2a
全基因组复制事件 (WGD)在被子植物基因组进化中起重要作用。在非洲百合基因组中，作者通过基因组内（Fig 2a）和与Ananas comosus、Asparagus officinalis以及Dendrobium chrysotoxum（Fig 2b）的基因组间比较发现了八个同源基因组区域的群组。
Fig 2b-c
基于非洲百合基因组中同义替换率Ks的分布和非洲百合与A. officinalis的系统发育分析（Fig 2c），作者推测非洲百合可能经历了三次全基因组复制事件，其中最古老的τ-WGD事件是大多数单子叶植物所共享。以τ-WGD事件作为时间基点，其他两次WGD事件分别发生在约7000-7500万年前（标记为ρ）和2000–2200万年前（标记为ω）。进一步与由ksrates38校正的分歧时间进行比较表明，第二次WGD事件ρ可能发生在非洲百子莲和大蒜属植物分歧之前，而第三次WGD事件ω可能发生在它们分歧之后。
Fig S5
基于非洲百合基因组中同义替换率Ks的分布和非洲百合与A. officinalis的系统发育分析（Fig 2c），作者推测非洲百合可能经历了三次全基因组复制事件，其中最古老的τ-WGD事件是大多数单子叶植物所共享。以τ-WGD事件作为时间基点，其他两次WGD事件分别发生在约7000-7500万年前（标记为ρ）和2000–2200万年前（标记为ω）。进一步研究发现，ρ-WGD可能发生在非洲百合和葱属植物分歧之前，而ω-WGD可能发生在它们分歧之后（Fig S5）。
此外，作者将在非洲百合和芦笋 (A. officinalis) 中鉴定到的同源区块映射到葱属基因组，鉴定出16个同源区块（Fig 2a-b），这暗示了葱属物种可能发生了4次WGD事件（2 × 2 × 2 × 2 = 16），包括两次葱属植物特有的WGD，一次非洲百合和葱属分化之前的，以及一次单子叶植物共享的。
综上所示，非洲百合和葱属的共同祖先首先共享了古老的 τ 和 ρ-WGD，然后分别经历了更近期的WGD事件。非洲百合在大约20-22百万年前经历了一次WGD事件（ω），而葱属物种在大约46-50百万年前的短时间内经历了两次WGD事件（α和β）（Fig 1c, Fig 2c）。
结论3 葱属植物大蒜素通路的进化
Fig 3a-b
尽管大蒜素 (allicin) 和异硫化大蒜素 (isoallicin, 翻译不一定准确) 的生物合成途径已经被报道（Fig 3a），但是在葱属植物中该通路的进化在很大程度上仍未知。
本研究中，作者在89个代表性植物物种中鉴定了参与大蒜素和异硫化大蒜素生物合成途径的同源基因，发现负责合成前体alliin/isoalliin的基因和编码水解酶的基因存在于大多数植物基因组中。然而，负责alliin/isoalliin裂解反应的关键酶alliinase和LFS基因的拷贝数在葱属植物中发生显著扩张。大多数植物物种只含有少量拷贝，而葱属植物包含多达60个alliinase基因和30个LFS基因的拷贝（Fig 3b）。
Fig 3c-d
代谢组学的分析表明，作为大蒜素生物合成前体的alliin含量在非洲百合中比大蒜、洋葱和大葱的组织中低了1000倍，这与先前的研究结果一致，表明大蒜素仅存在于葱属物种。对alliinase和LFS基因家族的系统发育分析显示，alliinase和LFS基因分别形成了15个和9个独立的分支（Fig 3c），其中许多分支被三个葱属物种共享。
alliinase基因和LFS基因均不属于WGD产生的共线性区块，而形成了染色体上某些特定的簇，表明它们起源于局部的基因重复。此外，大蒜素/异硫化大蒜素合成途径基因主要分布在大葱和洋葱的2号染色体上，而在大蒜上分布在1号染色体上，这种分布模式可能有利于转录共调控。
此外，作者还检测到在葱属中大蒜素生物合成途径的几个基因存在正选择和快速进化，比如，两个关键酶基因，GGT（编码γ-谷氨酰转肽酶）和PCS1（编码植物硫蛋白合成酶），在三个葱属物种的祖先分支上经历了强烈的正选择（Fig 3d）。
结论4 葱属植物免疫系统的进化
Extended Data Fig. 7
通常，植物通过一个由模式触发免疫和效应器触发免疫组成的双重内在免疫系统来识别病原体感染。作者通过转录组分析揭示了洋葱叶片在感染病原真菌后，大蒜素生物合成途径七个基因中的六个表达上调，上调的基因在MAPK信号通路中显著富集（Extended Data Fig. 7 a-b）。先前的研究报道植物免疫系统通过激活MAPK信号通路来启动下游基因响应，由MAPK通路激活的两个重要转录因子，WRKY22/WRKY29和MYB，与W box和Myb识别元件特异地相互作用，启动植物中许多免疫响应基因的表达。
在本研究中，作者通过在大蒜素/异硫化大蒜素生物合成途径基因的上游序列中搜索这些顺式调控元件，发现了与三个参与大蒜素/异硫化大蒜素生物合成的酶编码基因有关的W box元件。这些发现表明，植物免疫系统可能通过WRKY22/29或MYB转录控制调节大蒜素/异硫化大蒜素的生物合成，大蒜素生物合成途径在真菌或细菌感染时上调，并可能有助于对一般微生物感染的下游免疫响应。
结论5 洋葱鳞茎次生代谢的空间图谱
Fig 4a-c
洋葱是一种两年生植物，鳞茎作为储存器官可用于过冬。洋葱的鳞茎包含多种次生代谢物，包括类黄酮、黄烷醇和花青素。在本研究中，作者选择了三个发育阶段的洋葱鳞茎进行了Stereo-seq测序。Stereo-seq通过时空捕获芯片，结合原位RNA捕获，实现了500nm的分辨率，同时捕获面积可达13cm×13cm，成为全球首个同时实现“纳米级分辨率”和“厘米级全景视场”的技术，且实现了基因与影像同时分析。与当前其他技术相比，在相同的精度下，Stereo-seq具备更灵敏和更强的mRNA捕获能力。该技术作为新时代的分子 “显微镜”，为重新认知器官结构、生命发育、物种演化和定义人类疾病提供了底层工具，将推动继显微镜和DNA测序技术以来的生命科学领域第三次科技革命（https://zhuanlan.zhihu.com/p/509617868）。
作者对空间转录组矩阵进行了无监督聚类，并基于细胞形态、空间位置和marker基因分为六种细胞类型，包括海绵样肉质细胞、栅栏细胞、基底薄壁细胞、表皮细胞、叶脉细胞和木质细胞（Fig 4a–c）。
Fig 4d-h
先前的研究表明，在洋葱鳞茎中，CHS（编码香豆素合酶）、CHI（编码香豆素异构酶）、F3H（编码类黄酮 3-羟基化酶）、F3′H（编码黄酮 3′-羟基化酶）、F3′5′H（编码黄酮 3′5′-羟基化酶）和FLS（编码黄酮合酶）基因参与了类黄酮合成，FLS将二氢黄酮转化为黄酮。洋葱中的主要类黄酮是槲皮素（Fig 4d），据报道槲皮素在洋葱中具有抗氧化活性和抗病性。除了F3′5′H外，这些基因在簇之间表现出差异表达和在表皮细胞中的共表达，表明洋葱鳞茎的表皮细胞是类黄酮合成的中心（Fig 4e）。
此外，脂质转运蛋白基因家族（LTP）在空间转录组测序和RNA原位杂交中表现出再表皮细胞的特异性表达（Fig 4f），这与之前在拟南芥和玉米中的发现一致。LTP蛋白参与了角质蜡的合成，这是一种疏水性成分，可以防止非气孔水分散失并提供对有害元素的保护。因此，LTP可能在洋葱鳞茎中具有重要的防水和抗虫作用。
结论6 鳞茎形成和进化相关的基因
Fig 5a
之前的研究表明，洋葱鳞茎的形成始于最内层已经出现的叶鞘中的细胞体积扩张，然后是叶片从外到内的扩张。在鳞茎中，海绵样肉质细胞是占主导地位的细胞类型，它们的扩张是鳞茎形成的形态学基础。
为了阐明它们的分子生物学过程，作者从空间转录组测序矩阵中收集了与海绵样肉质细胞相关的信息，并使用monocle3构建了谱系分化轨迹（Fig 4g）。伪时间分析显示，随着洋葱鳞茎的发育，海绵样肉质细胞显示出从内层到外层、从基部到顶部的连续细胞轨迹（Fig 4g）。这表明细胞扩张首先发生在远离茎基部的外层鳞茎中。对于每一层的鳞茎，海绵样肉质细胞扩张的顺序是从外缘到内缘，表明内缘细胞开始较早扩张，并在稍后接近外缘细胞的扩张推动下被推向更深的地方。
鳞茎的形成是细胞形态上有序的时空变化过程。为了进一步研究细胞扩张轨迹背后的分子过程，作者对海绵样肉质细胞谱系的空间表达矩阵进行了差异分析，并对具有最低q值的前1,000个基因做了富集分析。在细胞扩张过程中表达变化最为显著的基因， 主要与微管、细胞骨架、脱落酸以及木质纤维素相关，表明这些过程在细胞扩张中起着重要作用（Fig 4h）。
基于空间转录组分析和先前的研究，鳞茎的形成可能涉及几个细胞生物学过程，包括细胞骨架重组、细胞渗透压调节和植物激素相互作用。因此，作者针对这些细胞过程做了基因的演化和表达分析。在长日照条件下，叶鞘细胞的扩张在鳞茎的发育过程中通过皮层微管重新排列从纵向转变为横向。本研究中，与微管重新排列有关的腺苷三磷酸马达蛋白相关的基因，包括α-管蛋白基因（TUA）、β-管蛋白基因（TUB）、γ-管蛋白复合物组分4基因（GCP4）、管蛋白折叠辅因子C基因（TFCC）和脆纤维/类似肌动蛋白KIN-4A基因（FRA），在洋葱中处于正选择状态（Fig 5a）。
Fig 5b-e
FRA调节皮层微管稳定性，而TUA编码管蛋白α链。这两个基因在洋葱中的正选择可能有助于解释洋葱和大葱在鳞茎形成过程中的表型差异。洋葱早期和晚期的鳞茎形成明显的球状结构，其叶鞘变厚，而大葱的叶鞘在整个鳞茎的形成早期和晚期都是光滑的。此外，作者发现在洋葱的第二片叶鞘（从外到内）中，FRA在早期发育阶段在表皮细胞和最外层两到三层细胞中持续表达，但在鳞茎形成晚期阶段扩展到最外层五到六层细胞（Fig 5b,d,b′,d′）。此外，在鳞茎形成晚期，只在第二片叶鞘的内部细胞中检测到TUA的表达（Fig 5c,e,c′,e′）。在大葱的第二片叶鞘中，在任何阶段都未观察到这两个基因的表达（Fig 5f–i,f′–i′），尽管在最外层的叶鞘中检测到了微弱的表达（Fig 5h,i,h′,i′）。然而，使用空间转录组测序，并没有观察到FRA和TUA基因的明确表达模式，可能是因为它们的表达量相对较低。这些结果表明，在研究低表达基因时，RNA原位杂交是空间转录组测序的重要补充。此外，与肌动蛋白纤维运动和肌动蛋白相关蛋白2/3复合物基因（ARP2/3） 相关的基因也在洋葱中处于正选择状态（Fig 5a），这些结果表明与细胞骨架相关的基因，包括微管和肌动蛋白纤维，可能在洋葱鳞茎的形成中发挥作用。
Fig 5f-i
此外，作者鉴定到四个可能参与细胞壁重塑的基因和两个可能参与细胞渗透调节的蔗糖代谢基因在洋葱中处于正选择或迅速进化的状态，可能影响了鳞茎的扩张（Fig 5a）。上述过程受许多植物激素的共同调控，包括生长素、赤霉素、油菜素内酯、脱落酸和茉莉酸。
实际上，作者发现五个植物激素途径中的多个基因处于正选择或迅速演化的状态（Fig 5a），而植物激素信号传导途径基因在囊实质细胞的生长和扩张期间的差异表达基因中也富集（Fig 4h）。
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