1973年，美国BD公司和美国斯坦福大学合作，研发生产了其第一台商用流式细胞仪FACS I；20世纪80年代初期，最早的三色流式细胞仪出现，使流式细胞仪的应用范围逐渐扩大；到了20世纪90年代中期，出现了四色流式，流式细胞仪逐渐从科研单位进入医院的中心实验室和检验科，广泛应用于患者的免疫分型、微小残留检测等检测，成为现代化临床检验仪器的一部分。
常见流式细胞仪：本文仅介绍分析型
1. 基本介绍
1.1 上样需求与信息获取
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流式细胞术：在流动状态下，同时检测单个细胞的特性（特异、灵敏、多参数同时分析）
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样本种类：各种细胞，微生物，人工合成微球，其他（血清、血浆、培养上清、细胞裂解液）
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上样要求：浓度（5 x 10 ^5 ~ 1 x 10 ^7 cells/ml），体积 0.5 -1 ml，300目筛网过滤
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物理信息：微粒大小，微粒结构
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抗原表达信息：表面抗原、胞内抗原、核内抗原
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其他：核酸、分泌蛋白、细胞因子
流式细胞仪可获取信息
1.2 常见的应用领域
2021年基于我国流式用户分布，58%的用户为科研单位，占比第二的为医院36.45%。
1.2.1 科研领域
细胞周期分析：在细胞周期的各个时期，DNA的含量随各时相呈现出周期性的变化。通过核酸染料标记DNA，并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1%，S%及G2/M%。了解细胞的周期分布及细胞的增殖活性。也可利用细胞周期蛋白(CYCLIN)、Ki67、核增殖抗原(PCNA)等，对细胞周期进行精确的分期：G0、G1、S、G2、M。
细胞周期分析应用于：肿瘤的早期诊断、肿瘤的良恶性判断、观察细胞的增殖状态及周期分布和疗效监测
细胞凋亡分析：正常的细胞膜结构为磷脂双分子层，磷脂酰丝氨酸（蓝绿色小球）位于细胞内膜，细胞发生凋亡后，磷脂酰丝氨酸（蓝绿色小球）发生外翻，通过荧光染料PE标记的Annexin V蛋白与磷脂酰丝氨酸在钙离子存在的条件下结合，联合PI筛选凋亡细胞（死细胞具有膜通透性，显示PE和PI双阳性）
早期凋亡分析
细胞增殖能力检测：利用染料CFSE通过DMSO扩散到细胞内，可以与蛋白质的胺基发生偶联（标记上蓝色的荧光），细胞有丝分裂时被染料标记的蛋白质也会被一分为二，增殖的代数越多荧光强度越弱（表现为成倍的降低）
细胞增殖能力检测：图中从左-->右增殖能力逐渐增强
胞外-细胞因子检测： 细胞因子较多时可以选用CBA的方法（小于2种推荐ELISA），收集含有细胞因子的上清与标记有不同细胞因子一抗的不同荧光强度的beads孵育（beads荧光强度区分不同细胞因子），然后再与携带荧光素的二抗孵育，流式分析图中可以看到：纵轴-beads荧光强弱-表示不同细胞因子；横轴-二抗荧光强度-表示对应细胞因子的浓度
CBA法可以检测30+种细胞外细胞因子
胞内-细胞因子检测： 首先抑制胞内蛋白分泌，然后做细胞膜打孔，使得荧光素标记的抗体进入胞内（固定破膜：便是使胞浆不具有流动性后在细胞膜上打孔），与细胞因子结合后通过流式检测。
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检测淋巴细胞亚群：监测细胞免疫状态(淋巴细胞是机体免疫系统功能重要的大细胞群，在免疫应答过程中，末梢血淋巴细胞发育分化成为功能不同的亚群。当亚群的数量和功能发生异常时，就能导致机体免疫紊乱并产生病理变化
1.2.2 临床领域
以白血病为例，从 初筛阶段 开始，基于流式细胞术的异常淋巴细胞亚群及绝对计数结果能够给与临床初步判断信息；在 诊疗阶段，更为明确的白血病分型及MRD监测有助于为治疗方案选择、临床疗效分析、预后判断、复发监测等方面提供更加精准的医学决策支持，而在 免疫重建过程中，多参数流式细胞术结果对于及时评价患者的细胞免疫功能，指导免疫抑制剂等药品的使用种类和剂量等方面均具有重要价值。
临床检测都有标准化的检测方案，可以直接上机调用建立好的内置模板，使用比较方便
1.2.3 工业领域
细胞免疫治疗，药物开发，细胞技术开发
2. 流式细胞仪组成和工作原理
传统的分析型流式细胞仪主要由以下三大系统组成：液流系统，光学系统，电子系统。
流式细胞仪组成和工作原理
2.1 液流系统
液流系统： 也就是液流的驱动系统，主要提供动力。我们的样本在压力的作用下由鞘液包裹着单细胞流经流动池。
鞘液 是无荧光本底的平衡电解质溶液，主要成份为氯化钠、氯化钾、乙二胺四乙酸二钠和抑菌剂，它作为库尔特流式细胞仪对细胞等生物粒子的理化及生物学特性进行分析时的鞘液使用。
液流系统的核心元件为 流动室，细胞在流动室内是一个个排列检测的，细胞和激光器处于一个正交状态，检测会更准确。
- 如果有气泡：细胞核激光不会呈现正交状态，CV值变大
- 如果有杂质：对激光进行反射
- 上样时避免样本走空，进入大量空气使激光照射流动室灼伤元件
流动室的构造
2.2 光学系统
单细胞悬液在流动池中经过激光器的激发（细胞样本携带有荧光染料），荧光染料经过激光器的激发发出不同波长的激发光，经过接收系统接收。
2.2.1 散射光信号
- 前向角散射光（Forward Scatter, FSC）：提供细胞“相对大小”信息。
- 侧向角散射光（Side Scatter, SSC）：提供细胞 “颗粒度” 信息（细胞复杂程度）
前向角散射光 & 侧向角散射光
下图为人外周全血细胞（红细胞溶解后）的分群图：FSC表示细胞相对大小，SSC表示细胞相对复杂程度，紫色的细胞群代表结构复杂且体积相对最大的中性粒细胞，绿色的细胞群代表同样体积较大但结构稍简单的单核细胞，而左下角黑色的小点点为杂质或细胞碎片
散射光信号-流式分析结果-人外周全血细胞
2.2.2 荧光信号
检测原理：使用荧光标记的单克隆抗体染色（做多色分析），荧光信号强弱反映了细胞抗原的表达含量
举例：流式双参数散点图（CD3-CD19- CD3+CD19- CD3-CD19+）CD3 FICT CD19 APC 一般都用CD3定位T淋巴细胞
荧光信号强弱反映了细胞抗原的表达含量
选择荧光素抗体需要了解 荧光素特征光谱，以适配仪器
- 关注仪器的激发光波长：通常在激发光谱的波峰位置（达到最大的激发效率）
- 关注仪器的探测器（滤光片+PMT）：发射光谱的波峰位置尽量在滤光片能接收波长的范围内（达到最大的接收效率）
BD光谱查看器：虚线为激发光谱，实线为发射光谱，框框为滤光片的波长范围；PMT元件就是用来放大荧光信号强度的，可以通过电压调节（提高检测灵敏度）
实际应用中，仪器搭配3种滤光片来使用：longpass(LP)、shortpass(SP)、bandpass(BP)，它们置于荧光探测器前，限定其接收的荧光波长的范围，从而将一束混合的荧光区分开来，分别进行收集。
- LP 500：波长大于500nm的光可通过
- SP 500：波长小于500nm的光可通过
- BP 500/50：波长在500±25nm的光可通过
2.3 电子系统
功能：将光信号转换为数字信号
2.3.1 流式图如何形成
细胞进行检测的时候都是单细胞级别（一个个得获得细胞体积信息和表面蛋白信息），因此每个细胞在后续检测通道都会形成一个独特的数值，类似于单细胞测序的表达矩阵（不过信息量要小很多）。
举例：相似的细胞具有相同的PE和FITC值，因而在图片上有相似的落点，相似的落点集合在一起便形成了图片上我们看到的聚集群
流式图的形成
2.3.2 流式图如何选取
传统流式细胞术都是用直方图、二维散点图或等高线图三种形式展现，其中等高线图更多得用于辅助圈门
直方图，二维散点图，等高线图（等高线越密集，说明落在该区域的细胞多）
3. 操作注意事项
精确的分析结果需要搭配合理的流式对照，排除 自发荧光 和 非特异性荧光 的干扰
特异性结合： 抗体Fab段与抗原的结合
非特异性结合：抗体Fc段与抗原的结合
流式对照的意义：去除非特异荧光和自发荧光
3.1 阴性对照（Isotype control，设定实验检测条件）
阴性对照的作用 主要在于设定实验检测条件，如调节散射光电压（看到细胞群体）、设定阈值（看到观测范围）、调整荧光电压（确定阴性细胞位置）。目前有两种方式：
- 空白对照：样本（单细胞悬液）不做抗体标记跑流式分析，去除自发荧光的干扰
- 同型对照：样本（单细胞悬液）用 “同型对照抗体” 孵育后跑流式分析，去除自发荧光+非特异荧光的干扰
同型对照抗体设置原则：（1）相同种属来源；（2）相同免疫球蛋白及亚型；（3）相同荧光素标记；（4）相同剂量和浓度；（5）由未免疫动物血清纯化而来
举例：BD的同型对照抗体
3.2 单阳性对照（调节荧光补偿）
3.2.1 荧光补偿-定义
荧光补偿（colour compensation）：在流式细胞多色分析中，纠正荧光素发射光谱重叠（spectral overlap）的过程，即从一个被检测的荧光信号中去除任何其他的干扰荧光信号。
荧光素的发射光谱重叠：图中滤光片所框选到的红色部分（可见绿色-FITC染料对黄色-PE检出有影响）；荧光补偿：通过FITC单染管的流式分析，去除PE通道内的FITC阳性信号
3.2.2 荧光补偿-实验设计
在双色或多色分析中，都要消除荧光素发射光谱重叠的干扰
- 明确已知的单阳管样本
- 使用单种荧光素标记的单克隆抗体和其余荧光素对应的同型对照抗体分别进行染色
- N色分析需要制备N个单阳对照管
举例 FITC&PE双色分析：（1）首先增加同型对照抗体（IgG1-FITC 和 IgG2a-PE）：用来设定实验检测条件；（2）设置FITC单阳对照管（CD3-FITC 和 IgG2a-PE）：排除FITC发射光谱对PE的影响；（3）设置PE单阳对照管（IgG1-FITC 和 CD4--PE）：排除PE发射光谱对FITC的影响；（4）检测管：同时增加CD3-FITC和CD4--PE孵育后正式做样本分析
举例FITC-PE双染荧光补偿的调节：
- 第一步：阴性对照调节电压确定阴阳性界限
- 第二步：通过FITC单阳对照管-调整图 “横平”
- 第三步：通过PE单阳对照管-调整图 “竖直”
补偿模型：FITC-PE双染举例
补偿原则：阴性median值与对应的单阳性对照median值大小相似
补偿原则：阴性median值与对应的单阳性对照median值大小相似
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