前言
人源性组织异种移植(patient-derivedxenografts , PDX)模型是一种将肿瘤患者的肿瘤组织移植至重症免疫缺陷型小鼠(NSG)体内,并使肿瘤组织在小鼠体内生长形成第一代移植瘤（图 1）。
图1 PDX模型概述
待其生长到一定大小时，取出该移植瘤组织并在无菌操作条件下移植到新一批小鼠体内，形成第二代移植瘤。如此重复操作形成移植瘤第三代、第四代等。
此种模型尽可能保留了亲代肿瘤的生长微环境，利于更好的表现亲代肿瘤性状，并且维持了肿瘤的异质性。
但同时也存在两个主要的问题，一是，从该模型中提取出的 DNA 片段不仅包含人类的基因，也存在一定比例的小鼠片段。另外一个问题就是该模型缺少配对的正常样本。
今天主要是想解决第一个问题：如何从 PDX 模型中去除小鼠的 reads。
工具评估
目前，已有很多文章利用各种不同的工具来去除 PDX 模型中的小鼠 reads。其中，用的比较多的工具有（表 1）：
表1 消除小鼠reads的六种工具
2020 年 Yvonne A Evrard 等人通过模拟 WES 和 RNA-Seq 数据集来比较其中五个工具消除小鼠 reads 的功效。
其模拟方式为，在人类样本的测序 reads 数据中，掺入不同比例的小鼠基因组 reads。
结果显示，所有工具在 WES 和 RNA-Seq 测试数据中准确率均高达 99％（图 2）。
图2 五种工具性能评估
其中 XenofilterR 的召回率最低（在 WES 和 RNA-seq 中，召回率分别为 96.60％ 和 89.63％）
BBSplit 的整体性能最好，即在没有任何召回损失的情况下具有最高的精度（在 WES 和 RNA-seq 数据中的准确率分别为为 99.87％ 和 99.64％）。
另外我们利用作者提供的数据展示了在不同 SE(单端) 阈值下各个工具的真阳率和假阳率（图 3）。
图3 不同SE阈值下各个工具的真阳率和假阳率
从左图中我们可以看出 Bamcmp 和 Xenome 两个工具在不同的 SE 和 PE(双端) 阈值下的真阳性率都达到 99% 以上。
但是，从右图中可以看出 Bamcmp 在不同的 SE/PE 阈值下的假阳性不稳定，有时候甚至高达 0.2%，而 Xenome 相对来说比较稳定，在不同情况下均低于 0.05%。
综合以上结果，我们认为 Xenome 是相对比较好的一个用来去除小鼠 reads 的工具。
Xenome 简介
Xenome 是Thomas Conway1 等人在 2012 年提出来的，该工具从开发到现在每年都有被引用（图 4），其中包含很多高分的文章（表 2）。
图4
表2 引用 Xenome 工具的高分文章
Xenome 使用宿主参考序列和移植物种参考序列，在比对时的所有可能的 k-mers 是否具有以下特征来表征它们所属的类别：
- 只匹配移植物(
graft)，即非host - 只匹配宿主(
host)，即非graft - 匹配两个物种
- 都不匹配
- 部分
k-mers在宿主与移植之间存在单碱基替换的差异
给定一条 read 或 配对 reads，xenome 将计算其 k-mers 属于上述类别中的哪一个，并将其分类为：graft，host，both, neither 或 ambiguous 其中之一（图5）。
图5 k-mers 可能属于的不同类别
Xenome 的使用
Xenome 有两个不同的功能块，使用两个单独的命令来调用：index 和 classify。
1. index
参数列表
index
-D [ --debug ] arg 启用特定的调试输出
-h [ --help ] 显示帮助信息
-l [ --log-file ] arg 指定输出信息文件
-T [ --num-threads ] arg 设置最大线程
--tmp-dir arg 中间文件输出目录 (默认为 /tmp)
-v [ --verbose ] 显示程序运行进度
-V [ --version ] 显示软件版本
-M [ --max-memory ] arg 设置最大内存(GB)
-P [ --prefix ] arg 设置索引前缀，可以带路径但是文件夹必须存在
-G [ --graft ] arg 移植物参考基因组 FASTA 文件
-H [ --host ] arg 宿主参考基因组 FASTA 文件
-K [ --kmer-size ] arg kmer 长度(默认为 25)
在对 reads 进行分类之前，必须根据移植物和宿主参考序列构建索引。参考基因组序列必须为 FASTA 格式及其压缩格式（gzip）。
xenome index -M 24 -T 8 -P idx -H mouse.fa -G human.fa
我们构建的索引文件为
$ ls
idx-both.header idx-both.lhs-bits idx-graft.kmers.low-bits.lwr idx-host.kmers.low-bits.lwr
idx-both.kmers-d0 idx-both.rhs-bits idx-graft.kmers.low-bits.upr idx-host.kmers.low-bits.upr
idx-both.kmers-d1 idx-graft.header idx-host.header
idx-both.kmers.header idx-graft.kmers-d0 idx-host.kmers-d0
idx-both.kmers.high-bits idx-graft.kmers-d1 idx-host.kmers-d1
idx-both.kmers.low-bits.lwr idx-graft.kmers.header idx-host.kmers.header
idx-both.kmers.low-bits.upr idx-graft.kmers.high-bits idx-host.kmers.high-bits
可以看到，索引都是以我们指定的 idx 作为前缀
有了索引之后，我们就可以来对 reads 进行分类了。
2. classify
参数列表
classify
-D [ --debug ] arg 启用特定的调试输出
-h [ --help ] 显示帮助信息
-l [ --log-file ] arg 指定输出信息文件
-T [ --num-threads ] arg 设置最大线程
--tmp-dir arg 中间文件输出目录 (默认为 /tmp)
-v [ --verbose ] 显示程序运行进度
-V [ --version ] 显示软件版本
-M [ --max-memory ] arg 设置最大内存(GB)
-P [ --prefix ] arg 设置索引前缀，可以带路径但是文件夹必须存在
-I [ --fasta-in ] arg 输入 FASTA 文件
-i [ --fastq-in ] arg 输入 FASTQ 文件
--line-in arg 输入文件的每一行是一个序列
--dont-write-reads 不产生 reads 输出文件
--graft-name arg graft reads 的名称
--host-name arg host reads 的名称
--output-filename-prefix 输出文件前缀
--pairs 双端测序文件
--preserve-read-order 在输入文件中保持 reads 的顺序
我们可以输入一个待分类的样本，可以是 FASTA、FASTQ 格式或对应的压缩格式（gzip），还支持每行代表一个序列的文本文件
xenome classify -P idx -i in.fastq
运行完此步骤之后，会为每种 reads 生成一个单独的文件，输出文件可能会有这些：
ambiguous.fastq
both.fastq
graft.fastq
host.fastq
neither.fastq
输出的 reads 文件的格式是与输入文件的格式一致的。
也可以同时指定多个输入文件，但是所有相同格式的输入都将被写入同一个输出文件。例如
xenome classify -P idx -i inA.fastq -i inB.fastq -I inC.fasta
将会产生以下文件：
ambiguous.fasta
ambiguous.fastq
both.fasta
both.fastq
graft.fasta
graft.fastq
host.fasta
host.fastq
neither.fasta
neither.fastq
每个 FASTQ 文件都包含来自 inA.fastq 和 inB.fastq 两个的 reads 的混合结果。FASTA 文件包含来自 inC.fasta 的读取。
如果不想混合来自不同文件的输入 reads 的结果，只能分开运行了。可以通过设置不同的输出文件前缀来区分来自不同的样本的 reads。例如
xenome classify -P idx -i inA.fastq --output-filename-prefix A
xenome classify -P idx -i inB.fastq --output-filename-prefix B
运行上面的命令将产生如下结果：
A_ambiguous.fastq
A_both.fastq
A_graft.fastq
A_host.fastq
A_neither.fastq
B_ambiguous.fastq
B_both.fastq
B_graft.fastq
B_host.fastq
B_neither.fastq
Xenome 还可以处理双端测序的输入文件，例如
xenome classify -P idx --pairs -i in_1.fastq -i in_2.fastq
这将会为每个种类的 reads 输出结果文件名添加配对的 _1 和 _2 后缀来区分
ambiguous_1.fastq
ambiguous_2.fastq
both_1.fastq
both_2.fastq
graft_1.fastq
graft_2.fastq
host_1.fastq
host_2.fastq
neither_1.fastq
neither_2.fastq
如果需要，可以指定其他名称来替换 host 和 graft。例如
xenome classify -P idx -i in.fastq --graft-name human --host-name mouse
将会产生下面的结果
ambiguous.fastq
both.fastq
human.fastq
mouse.fastq
neither.fastq
classify 命令在分类完 reads 之后，还会将每种类型的 reads 的统计信息打印到屏幕上。
Statistics
B G H M count percent class
0 0 0 0 59 0.00561983 "neither"
0 0 0 1 0 0 "both"
0 0 1 0 1977 0.188312 "definitely mouse"
0 0 1 1 565 0.0538171 "probably mouse"
0 1 0 0 362260 34.5058 "definitely human"
0 1 0 1 279050 26.5799 "probably human"
0 1 1 0 385 0.0366718 "ambiguous"
0 1 1 1 856 0.0815352 "ambiguous"
1 0 0 0 138 0.0131447 "both"
1 0 0 1 6 0.000571509 "probably both"
1 0 1 0 256 0.0243844 "definitely mouse"
1 0 1 1 3812 0.363098 "probably mouse"
1 1 0 0 34360 3.27284 "definitely human"
1 1 0 1 359172 34.2116 "probably human"
1 1 1 0 241 0.0229556 "ambiguous"
1 1 1 1 6716 0.639709 "ambiguous"
Summary
count percent class
1034842 98.5702 human
6610 0.629612 mouse
144 0.0137162 both
59 0.00561983 neither
8198 0.780871 ambiguous
在 Statistics 部分的信息中，B(both)、G(graft)、H(host)、M(marginal) 下面的 16 行表示这些分类的组合(4×4)，1 表示属于该类，0 表示不属于。
count 表示每种子分类的 reads 数目，以及后面的 percent 表示 reads 数目占比。最后的 class 表示这一子类所属的最后的分类。
而在 Summary 部分的信息中，将上面的数据进行了汇总。最后被输出的分类中，各分类的 reads 数目及其占比
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