王利老师2020年发表在circulation上的文章
总体思路：
1. Single-Cell Analysis of Pathological Cardiac Hypertrophy in a Mouse Model of Pressure Overload
Fig 1A：送样流程，取了0, 2, 5, 8, 11周的TAC小鼠心尖区和非心尖区的心肌和非心肌，分别送了单细胞测序。
0w：正常对照；2w：肥厚with正常EF；5w：肥厚with异常EF；8-11w：心衰。
iCell8 platform (Takara)
Fig 1B：麦胚凝集素 (WGA)染心肌细胞膜，随病程进展，心肌细胞出现明显肥大。
Fig 1C：各时间点细胞数和心尖区/非心尖区，心肌/非心肌数目统计。
Fig 1D：所有细胞UMAP注释图，得到6个细胞群。
Fig 1F：6个细胞群的高变基因热图展示，不同细胞群间区分度较好。热图上同时标示了每个群的marker基因。画法之前写过：ComplexHeatmap绘制带特定基因的单细胞热图
2. Characterization of Cardiomyocytes at Different Stages of Pressure Overload–Induced Pathological Cardiac Hypertrophy
对心肌进行亚群细分。
这个思路值得学习先分cluster，再用Mean spearman cor做相关性分析来分功能性亚群，然后做验证。
Fig 2A B：心肌细胞分成了10个亚群CM0-9，A是按cluster着色，B是按送样时期着色。
Fig 2C：心肌细胞分成了10个亚群top marker gene的热图（感觉单看这个图的话，群和群之间的区分不是很大哎）
作者除了scRNAseq以外也测了bulkRNAseq，用来验证scRNAseq的结果。
Supplemental Fig 3A：不同时期不同样本的比例饼图
Supplemental Fig 3B C：B显示不同时期的心肌细胞样本，两个组学的logTPM相关度较好。C. ？
Supplemental Fig 3D E：和预期的一样，两个肥心相关基因Nppa和Nppb随病程发展逐渐升高。
Supplemental Fig 3F：Structural 和 calcium handling基因出现先升高后降低
Supplemental Fig 3G：代谢相关基因在病程中出现持续降低。
为了 更多的聚焦心肌细胞的功能，作者根据transcriptome similarities将心肌细胞分为了4个功能性亚群（functional cluster, FC1-4）
Fig 2D E：根据transcriptome similarities分的四个FC和对应的代表性基因及通路富集。参考：不同单细胞群之间的相关性分析
FC1 (CM0, 2, 3, and 6)高表达Lrp5，可能参与tissue remodeling。FC2 (CM7, 8), 表现出经典的心肌细胞特性，包括心肌细胞发育，代谢和细胞收缩。比较surprising的是FC3 (CM1,4,9)和FC4 (CM5)高表达经典的内皮和成纤维的marker，比如Cdh5和Vwf以及Vim和Dcn。各自的功能见图E。
Fig 2F：四个群的marker基因在10个cluster的表达，辅助验证图DE
Fig 2G H I J：为了验证FC3和FC4这两群高表达经典的内皮和成纤维的marker的非经典心肌（证明不是双细胞，而是确实表达了），用流式（G），谱系示踪小鼠（H）和单细胞western blot（I J）做了验证。
Fig 2K：不同细胞群随时间变化的proportion change
小结： Together, these findings highlight the presence of multiple functional cardiomyocyte subtypes and their potential roles in heart function.
3. Characterization of Noncardiomyocytes at Different Stages of Pathological Cardiac Hypertrophy
Fig 3A B C：成纤维分了9个群，A图是每个群不同时期的比例变化，高表达包括Postn在内的ECM蛋白的FB1和FB6细胞群比例增加，提示心肌肥厚晚期活化的成纤维比例增加；B图是每个群代表基因的热图，C是功能富集结果。
Fig 3D E F：内皮细胞分了9个群，和上面三个图模式一样，提示心肌肥厚进展过程中，EC细胞群出现了功能shift，即从正常心脏中负性调节炎症反应的EC2转变成了心衰中参与肌肉细胞发育的EC5和EC6。
Fig 3G H I：MP分为6个亚群，一些MP亚群如MP和MP5表达一些经典的心肌marker，比如Tnnt2，而且显示出一些心脏收缩，动作电位和血管生成的功能。中晚期巨噬细胞主要参与炎症反应，组织重构和血管生成。
小结：Together, these observations suggested that the functional specifications for noncardiomyocyte cell types are highly dynamic and thus may play active roles in driving disease progression.
4. Subtype Switching of Fibroblasts Highly Correlates With Hypertrophic Responses of Cardiomyocytes at Initial Stage of Cardiac Hypertrophy
病程间非心肌功能出现剧烈变化。因此，进一步想要去探究这些非心肌对心肌功能的影响。
首先对代表性的早期 (0w和2w) 主要细胞群 (CM0, CM1, CM2, CM4和CM5) 做了monocle拟时序分析。
用来做monocle的细胞群选择标准：1) The subclusters should account for >10% of total CM cells in any time point. 2) There were at least 10 cells supporting the potential conversion between two sub-clusters. 3) The conversion direction should not be conflicting with the proportion change of the clusters.
Potential cell conversion was calculated according to a previously reported method1.
Supplemental Fig 8A B：5个心肌细胞cluster的拟时序分析，B图提示，0w的心肌向2w的心肌分化的时候存在两个分支。
Supplemental Fig 8C：拟时差异基因分为了4个cluster，分别对这四个cluster的差异基因做了功能富集。1和2cluster的基因主要调控是2w-2 CM这个分支，参与细胞外基质形成，组织重构等过程。3和4cluster的基因主要调控是2w-1 CM这个分支，参与肌细胞增殖和凋亡过程。这种做完monocle把聚类基因提出来做富集的方法见：monocle2
随后，作者选择了在0-2w比例上调(MP3, EC4, T2和FB4)和下调(EC2, T0, FB3, MP5, EC1和FB5)的主要细胞群(10群)，做了细胞互作分析。
⚠️心肌和非心肌的互作的做法：在肥厚的进展早期(0-2w)过程中，作者假定发生了明显比例变化的NCM细胞群最有可能参与调控CM的变化。
(1) 首先选取了NCM各个时间点的主要细胞类型 (>10% of each main non-CM cells including EC, FB, MP and T cells，也就是去掉了中性粒)
(2) 在上面选出的四个大类的非心肌细胞群中，FB包括9个亚群，EC包括9个亚群，MP包括6个亚群，T细胞的分群没有看到？。作者计算了每个细胞亚群在相邻时间点变化的logFC，取了logFC绝对值最大的top 50%细胞群。这些细胞群根据比例上调还是下调被分为up和down细胞群。
(3) 随后作者使用Seurat的FindAllMarkers找了每个群的marker基因(q value < 1e-3)，和genes encoding secreted protein基因集取交集，讲得到的基因作为possible ligands。方法见：分泌蛋白基因列表下载。
(4) 为了保证这些ligands是在特意性在up/down细胞群里表达的，基因再次被过滤。标准是这个基因在一个群里的表达是在其他组表达的4倍以上。
(5) 对得到的所有gene做了GO和KEGG分析
(6) 和心肌拟时序得到的拟时差异基因和通路取交集，得到的通路和基因使用network包，sna包和GGally包绘制了如下的网络图
真的复杂...不愧是于老师...
Supplemental Fig 8E：筛选出来的基因和通路的网络图
Supplemental Fig 8F：筛选出来的由非心肌表达且和心肌相关ligands基因主要在FB5表达，提示这个细胞群可能潜在的影响心肌细胞的biological behaviors。
Supplemental Fig 8G：计算了上述基因在不同细胞群的sum of cell average expression，FB5最高
Supplemental Fig 8H：细胞群间的互作提示decreased interactions with FB5 was the most pronounced alterations in this transition。
小结：These observations suggested loss of protective factors from fibroblasts highly correlated to hypertrophy initiation.
5. Activation of Proinflammatory Macrophages Is the Key Event in the Transition From Normal to Reduced EF
分析完0-2周的变化，下一步是做2-5这个时间段的变化，思路和做法与前一部分一致。
Fig 4A-C：2-5周心肌细胞拟时序基因富集到immune re- sponse, response to cytokine and chemokine等通路，提示这个阶段有炎症反应参与其中。
Fig 4D：2-5周的时候，比例出现显著变化的非心肌
Fig 4E：2-5周心肌拟时相关基因和非心肌ligand基因取交集得到的基因富集到了很明显的炎症反应相关通路
Fig 4F：巨噬细胞明显活化，表达促炎性marker比如Lgals3。
Fig 4G：计算了上述基因在不同细胞群的sum of cell average expression，MP4和MP0都很高。
Fig 4H：免疫组化检测LGALS3，结果显示在5周心脏出现明显表达增强，提示巨噬细胞活化。
Fig 4G：免疫荧光检测2-5周心脏TNNT2, CD68, FAS的表达，结果提示巨噬细胞活化。
随后作者对这部分的结果进行了更进一步的验证
Fig 5A B：和2w相比，5周小鼠心脏MP4巨噬细胞的marker. CD68和PDGFRA出现明显高表达
Fig 5C：MP4和心肌细胞间的其他互作配体受体对
Fig 5D：免疫荧光验证Fig 5C
Fig 5E：2-5周期间altered cell-cell interaction，MP0和MP4处在一个比较核心的地方，supporting the hypothesis that macrophage subtype switching was a key event underlying the progression of pathological cardiac hypertrophy during 2 weeks to 5 weeks
Fig 5F：提取正常/5w心脏中的巨噬细胞和心肌细胞共培养，和5w巨噬共培养的心肌出现了明显的肥厚相关基因如Nppa 和Nppb的高表达。
小结：Together, our findings suggested a pivotal role of mac- rophage subtype switching toward an inflammatory state in the reduction of cardiac function during patho- logical cardiac hypertrophy.
6. Fibroblast and Endothelial Cell Subtypes Highly Correlate to Disease Progression at Late Stage of Pathological Cardiac Hypertrophy
和前面两部分一样的思路分析了5-11周的心肌发育轨迹和与非心肌的互作
5-11周主要是内皮和成纤维在起作用，主要参与了ECM remodeling等过程
7. Stage-Specific Pharmacological Inhibition of Macrophage Subtype Switching Attenuates Pathological Cardiac Hypertrophy
在肥厚发生过程中，从EF正常到EF异常（2-5w）是一个关键的时间点。前面的分析提示巨噬细胞在这个过程发挥了重要作用，所以作者使用了抗炎药dapagliflozin(达格列净)在这个时间点进行治疗，看是否可以起到抑制肥厚的发生。为了更好的证明结论，作者同时也使用了另外两个药TD139和arglabin，并设置了0-2周给药组进行治疗。
Fig 6A B：给药流程
Fig 6C D：0-2周给药和2-5周给药的小鼠心功能。可以看到 ，0-2周给药小鼠不能逆转心功能下降，但0-5周给药小鼠5-8周时心功能明显好于未给药组。
Fig 6E F：2-5周给药可以改善小鼠心脏肥大，减轻纤维化
Fig 6G H：活化的促炎巨噬细胞 可以表达LGALS3。2-5周给药可以显著降低LGALS3的表达，0-2周给药则不行 。
Fig 6I-M：2-5周给药后，促炎因子CCL6和CCL24，促肥厚因子NPPA和NPPB的表达也被明显抑制。
小结：Together, these results demonstrated the effectiveness of stage-specific targeting of macrophage in suppressing pathological cardiac hypertrophy, underscoring the importance of precise intervention in disease progression.
8. Hypertrophy-Related Transcriptomic Alterations Are Conserved in Human Samples
前面的实验都是在小鼠上做的，为了验证患者是否也有类似的表现，作者对8个正常对照，7个肥心患者心脏样本，7个心衰样本进行了 bulk RNAseq。
Fig 7A B：人类心脏样本中的巨噬细胞ligand基因的火山图和热图
Fig 7C：MP中上调的基因和HCM患者的up genes显著富集，提示人和小鼠具有一致性
Fig 7D-H：小鼠和人的内皮和成纤维基因表达一致性也比较好
Fig 7I：整个文章的总结图
参考文献：
- Briggs JA, Weinreb C, Wagner DE, Megason S, Peshkin L, Kirschner MW and Klein AM. The dynamics of gene expression in vertebrate embryogenesis at single-cell resolution. Science. 2018;360.
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