Trimmomatic 是一个功能强大的数据过滤软件。Trimmomatic 支持多线程，处理数据速度快，主要用来去除 Illumina 平台的 Fastq 序列中的接头，并根据碱基质量值对 Fastq 进行修剪。软件有两种过滤模式，分别对应 SE 和 PE 测序数据，同时支持 gzip 和 bzip2 压缩文件。另外也支持 phred-33 和 phred-64 格式互相转化，不过现在绝大部分 Illumina 平台的产出数据也都转为使用 phred-33 格式了。
虽然理论上接头序列和引物序列可能出现在 reads 中的任何位置，但实际上序列中出现接头和引物大部分情况下都是由于文库插入片段比测序读长短导致的，这种情况在 reads 的开头部分是有一段可用序列的，末端包含了接头的全长或部分序列，如果末端只有接头的一部分序列，那么去除这残缺的接头序列也不是容易的事。
一、Trimmomatic安装方法
- 通过conda安装
pip install --upgrade -i https://pypi.doubanio.com/simple/argparse
conda install -c bioconda trimmomatic
trimmomatic -h #安装好即可直接使用
二、Trimmomatic用法
- 语法
Usage:
trimmomatic PE [-version] [-threads <threads>] [-phred33|-phred64] [-trimlog <trimLogFile>] [-summary <statsSummaryFile>] [-quiet] [-validatePairs] [-basein <inputBase> | <inputFile1> <inputFile2>] [-baseout <outputBase> | <outputFile1P> <outputFile1U> <outputFile2P> <outputFile2U>] <trimmer1>...
or:
trimmomatic SE [-version] [-threads <threads>] [-phred33|-phred64] [-trimlog <trimLogFile>] [-summary <statsSummaryFile>] [-quiet] <inputFile> <outputFile> <trimmer1>...
- 参数说明
PE/SE 设定对Paired-End或Single-End的reads进行处理，其输入和输出参数稍有不一样。
-threads 设置多线程运行数
-phred33 设置碱基的质量格式，可选pred64，不设置这个参数，软件会自动判断输入文件是哪种格式
-trimlog 指定过滤日志文件名，日志中包含以下四列内容:read ID、过滤之后剩余序列长度、过滤之后的序列起始碱基位置（序列开头处被切掉了多少个碱基）、过滤之后的序列末端碱基位置、序列末端处被剪切掉的碱基数。
#由于生成的trimlog文件中包含了每一条 reads 的处理记录，因此文件体积巨大（GB级别），如果后面不会用到 trim日志，建议不要使用这个参数
-basein 通常 PE 测序的两个文件，指定其中 R1 文件名，软件会推测出 R2 的文件名，但是这个功能实测并不好用，建议不用-basein参数，直接指定两个文件名（R1 和 R2）作为输入
-baseout 输出文件有四个，使用 -baseout 参数指定输出文件的 basename，软件会自动为四个输出文件命名，过滤之后双端序列都保留的就是 paired，反之如果其中一端序列过滤之后被丢弃了另一端序列保留下来了就是 unpaired(即 成对的clean reads, 未成对的正向序列以及未成对的反向序列)
#一般情况下，若paired reads百分比占90%以上，可只对paired reads进行比对分析
ILLUMINACLIP:TruSeq3-PE.fa:2:30:10:8:true
切除adapter序列。参数后面分别接adapter序列的fasta文件：第一步 seed 搜索时允许的最大错配碱基个数2：palindrome模式下匹配碱基数阈值30：simple模式下的匹配碱基数阈值10(7-15之间）：palindrome 模式允许切除的最短接头序列为 8bp（默认值）：palindrome 模式去除与 R1 完全反向互补的 R2（默认去除false），但在有些情况下，例如需要用到 paired reads 的 bowtie2 流程，就要将这个参数改为 true，否则会损失一部分 paired reads。
#按照规定顺序，ILLUMINACLIP 各个参数之间以冒号分开，PE测序需要注意最后一个参数。对于SE测序最后两个参数可以不设置
LEADING:3 切除首端碱基质量小于3的碱基
#Illumina平台有些低质量的碱基质量值被标记为 2 ，所以设置为3可以过滤掉这部分低质量碱基。
TRAILING:3 切除尾端碱基质量小于3的碱基
SLIDINGWINDOW:15:20
滑窗质量过滤，一般一个read的低质量序列都是集中在末端，也有很少部分在开头。从5'端开始进行滑动，当滑动位点周围一段序列(window)的平均碱基低于阈值，则从该处进行切除。Windows的size是15个碱基（一般设置在10-30之间），其平均碱基质量小于20，则切除
MINLEN:50 可被保留的最短reads长度，应根据原始序列的长度而定
HEADCROP:<length> 在reads的首端切除指定的长度
CROP:<length> 保留reads到指定的长度
TOPHRED33 将碱基质量转换为pred33格式
TOPHRED64 将碱基质量转换为pred64格式
- 示例1
trimmomatic PE -phred33 /data/hushy/seqdata/RESP/study11/raw_reads/SRR6994256_1.fastq.gz /data/hushy/seqdata/RESP/study11/raw_reads/SRR6994256_2.fastq.gz -baseout /data/hushy/seqdata/RESP/study11/analysis/SRR6994256.fastq.gz ILLUMINACLIP:/export/home/hushy/miniconda2/pkgs/trimmomatic-0.39-1/share/trimmomatic-0.39-1/adapters/TruSeq3-PE.fa:2:30:10 LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:50
# /export/home/hushy/miniconda2/pkgs/trimmomatic-0.39-1/share/trimmomatic-0.39-1/adapters为接头序列的储存路径，其中TruSeq3-PE.fa与TruSeq3-SE.fa为illumina hiseq和miseq的接头，如果不是使用hiseq2000的，到illumina官网下载接头序列并放到这个文件夹中。TruSeq2对应着illumina GAII测序。
# 默认输出文件格式: SRR6994256_1P.fastq.gz SRR6994256_1U.fastq.gz SRR6994256_2P.fastq.gz SRR6994256_2U.fastq.gz
trimmomatic.png
trimmomatic PE -phred33 /data/hushy/seqdata/RESP/study11/raw_reads/SRR6994256_1.fastq.gz /data/hushy/seqdata/RESP/study11/raw_reads/SRR6994256_2.fastq.gz -baseout /data/hushy/seqdata/RESP/study11/analysis/SRR6994256.fastq.gz ILLUMINACLIP:/export/home/hushy/miniconda2/pkgs/trimmomatic-0.39-1/share/trimmomatic-0.39-1/adapters/TruSeq3-PE.fa:2:30:10:8:true LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:50
# 将ILLUMINACLIP的第6个参数改为true后，结果有94.09%的序列保留下来
trimmomatic-true.png
- 示例2
trimmomatic PE -phred33 ~/SRR733/SRR2854733_1.fastq ~/SRR733/SRR2854733_2.fastq \
~/SRR733/clsseq/SRR2854733_1_paired.fq ~/SRR733/clsseq/SRR2854733_1_unpaired.fq \
~/SRR733/clsseq/SRR2854733_2_paired.fq ~/SRR733/clsseq/SRR2854733_2_unpaired.fq \
ILLUMINACLIP:/usr/local/src/Trimmomatic/Trimmomatic-0.36/adapters/TruSeq3-PE.fa:2:30:10 \
LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:10:15 HEADCROP:8 MINLEN:36
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