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通过基因相关注释，可以知道变异位点在基因组上的位置和对蛋白质编码的影响。在进行注释之前，首先需要下载物种对应的数据库，以human为例，命令如下
annotate_variation.pl -downdb -buildver hg19 -webfrom annovar refGene humandb/
下载成功后，humandb的文件列表如下
├── annovar_downdb.log
├── hg19_refGeneMrna.fa
├── hg19_refGene.txt
└── hg19_refGeneVersion.txt数据库准备好之后，就可以进行注释了，命令如下
annotate_variation.pl —geneanno -buildver hg19 ex1.avinput humandb
运行过程中的log信息如下
NOTICE: Output files were written to ex1.avinput.variant_function, ex1.avinput.exonic_variant_function
NOTICE: Reading gene annotation from humandb/hg19_refGene.txt ... Done with 63481 transcripts (including 15216 without coding sequence annotation) for 27720 unique genes
NOTICE: Processing next batch with 21 unique variants in 21 input lines
NOTICE: Reading FASTA sequences from humandb/hg19_refGeneMrna.fa ... Done with 15 sequences
WARNING: A total of 405 sequences will be ignored due to lack of correct ORF annotation会输出两个文件，后缀分别为.variant_function和.exonic_variant_function。
1. variant_function
这个文件在输入文件的前面，新加了两列，第一列代表变异位点在基因上的区域，比如外显子，内含子，基因间区等；第二列给出对应的基因。示例如下
UTR5 ISG15(NM_005101:c.-33T>C)
UTR3 ATAD3C(NM_001039211:c.*91G>T)
intronic DDR2
intronic DNASE2B
intergenic UBIAD1(dist=43968),DISP3(dist=135699)
exonic IL23R
exonic ATG16L1annovar将基因组划分成了9种区间
-
exonic
-
splicing
-
ncRNA
-
UTR5
-
UTR3
-
intronic
-
upstream
-
downstream
-
intergenic
exonic特指编码蛋白的外显子区；UTR5和UTR3特指不翻译蛋白的外显子区；splicing指的是位于内含子边界（默认2bp以内）的区域；ncRNA指的是非编码蛋白的基因区域；intronic指的是内含子区；upstream指的是转录起始位点上游1Kb以内的区域；downstream指的是转录终止位点下游1kb以内的区域；intergenic值的是基因间区。
在判断一个变异位点所处区域时，以上9种区间的优先级是不同的，下图中列出了每种区间的优先级，数字越小，优先级越高。
如果一个变异位点位于某个基因区域时，第二列会给出对应的基因名称，如果有多个基因名称，则逗号分隔，比如
exonic ATG16L1
如果一个变异位点位点不在基因区域，第二列会给出上下游最近的基因的名字和距离，比如
intergenic UBIAD1(dist=43968),DISP3(dist=135699)
2. exonic_variant_function
这个文件只对位于exonic区间的变异位点，给出对应的氨基酸变化信息。在输入文件的基础上新增了3列，第一列代表行数，第二列代表变异类型，第三列代表氨基酸的变化情况，示例如下
line9 nonsynonymous SNV IL23R:NM_144701:exon9:c.G1142A:p.R381Q,annovar提供了以下几种变异类型
-
frameshift insertion
-
frameshift deletion
-
frameshift block substitution
-
stopgain
-
stoploss
-
nonframeshift insertion
-
nonframeshift deletion
-
nonframeshift block substitution
-
nonsynonymous SNV
-
synonymous SNV
-
unknown
在定义变异类型时，首先基于4种基本的变异类型，SNV, insertion, deletion, block substitution, 再结合其对蛋白编码的影响。对于SNV而言，引起了蛋白质变化的就是synonymous SNV, 蛋白质没有变化的就是
nonsynonymous SNV；对于剩下的3种基本变异类型，在考虑对蛋白质的影响时，分为了移码frameshift和非移码nonframeshift 两种。stopgain指的是突变之后，原本的密码子变成了终止密码子，stoploss指的是突变之后，原本的终止密码子变成了普通密码子，导致翻译情况变化较大。unknown代表不清楚该变异对蛋白的影响。
和分析变异位点所处区间类似，评估变异类型时也有优先级的区分，优先级如下
在表示蛋白质的影响时，annovar采用的是自己定义的表示规则，如果想要使用HGVS定义的规则，只需要在运行时添加-hgvs参数，示例如下
annotate_variation.pl —geneanno -buildver hg19 -hgvs ex1.avinput humandb
添加这个参数之后，exonic_variant_function文件的第三列示例如下
IL23R:NM_144701:exon9:c.1142G>A:p.R381Q
可以看到，采用的是HGVS的命名方式。
在使用annovar注释时，还有一个小技巧。因为只需要输入文件的前5列，当我们只有基因区间文件，比如bed格式的文件时，可以将4,5列用0填充，这样的格式annovar也是可以识别的，这样就可以对基因组上的区间进行基因相关的注释了。
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