riborex：差异翻译基因分析

  分析差异翻译基因时，为了保证结果的正确性，除了使用Xtail软件外，也用riborex分析了一遍，该软件封装了常规转录组常用的三种差异分析框架DESeq2、edgeR、Voom。另外，该软件还封装了fdrtool可以用来矫正pvalue。具体的代码示例可以参考软件文档，这里就不演示了，主要说说使用软件时需要注意的事项。

详细的使用说明书：
https://github.com/smithlabcode/riborex/blob/master/vignettes/riborex.pdf

  DESeq2做为常规转录组最常用的差异表达基因分析的框架，确实是一个不可多得的选择。同时，也对翻译组差异翻译基因的鉴定有着很大的影响，很多翻译组的差异分析软件也是基于这些框架而来。因此，这里说的注意事项是选择DESeq2做为riborex的分析引擎时，需要注意的地方。

  用DESeq2做差异分析时，最后提取差异结果时，默认设计矩阵中前面的分组做为参考，也可以提供contrast参数，指定如何提取结果，确定哪一个分组做为参考，弄不好得到的结果可能跟预期相反。例如，分组变量名为group，含有case、ctrl两个水平，那么最后提取差异时，可以用两种方式指定：

res <- results(dds, contrast=c("group", "case", "ctrl"))
# 或者下面的方式
res <- results(dds, name="group_case_vs_ctrl") 

  要明白放在后面的组名如ctrl是做为对照组的，如果case放在后面就会导致上下调基因反过来。虽然不是什么大问题，但有可能引起误导而浪费不必要的时间。

  那么，riborex使用DESeq2做为引擎分析差异基因时，最后也要根据contrast提取差异结果。例如，软件文档示例数据的分组情况如下：

rnaCond <- c("control", "control", "treated", "treated")
riboCond <- c("control", "control", "treated", "treated")

  虽然软件也提供了contrast参数用于指定如何提取，但好像该参数并那么好使。默认情况下，contrast无需指定，与DESeq2默认情况一样，前面的分组做为参考，即control为对照。但是，类似文档中只有Multi-factor experiment的示例格式指定这个参数：

  然而，不是Multi-factor experiment，该怎么办呢？比如样本分组情况如下：

rnaCond <- c("case", "case", "ctrl", "ctrl")
riboCond <- c("case", "case", "ctrl", "ctrl")

  通常习惯以对照组为参考，看处理组如何变化，默认的结果是以case做为参考，这显然有点反人类。如果想得到以ctrl为参考的结果，该怎么办呢？

  因为软件有contrast参数，所以第一时间想到用这个参数提取想要的结果，可是看了一圈发现不知道如何提供参数，也是无奈。当然，此路不通还有别的选择，比如可以将样本顺序颠倒一下就可以了，这样默认情况就是想要的结果。

  没办法，咱还是想搞清楚怎么提供参数，就去看了看软件的源码，关于contrast参数的代码如下：

  这段代码的else部分代码写法有点怪异，提供的contrast第一个元素要在combinedCond列名里面，而咱们根本不知道combinedCond内容是什么。既然倒腾了，那就倒腾明白吧，可以通过下面的方式提供参数：

contrast <- c('cond', 'case', 'ctrl')
res <- riborex(rna, ribo, rnaCond, riboCond, "DESeq2", contrast = contrast)

  contrast第一个元素得是cond，已经由代码的逻辑固定了。

  事实上，riborex只是封装了DESeq2，咱们也可以自行构建设计矩阵，直接使用DESeq2来做差异翻译基因分析。

protocol + condition + condition:protocol

  protocol为RNAseq和riboseq各样本的分组向量，condition为样本所属的数据类型分组向量，condition:protocol为前面两个的交互效应。

  riborex与xtail的结果重合度挺好，而xtail的结果更为保守，想要多一些的结果可以选择前者。